Protocoles de coloration pour des îlots pancréatiques humains
Summary
Cette vidéo montre des procédures pour la caractérisation des îlots pancréatiques humains en utilisant l'hématoxyline et l'éosine (H & E) et l'immunohistochimie (IHC). Sections du pancréas, de la tête, le corps et les régions de la queue sont colorées à la fois par H & E et IHC pour déterminer la composition du système endocrinien îlot (insuline, le glucagon, et le polypeptide pancréatique), la réplication des cellules (Ki67), et des infiltrats inflammatoires (H & E, CD3). La région est localisée à l'aide unciforme IHC pour le polypeptide pancréatique.
Abstract
Estimations de la superficie des îlots et les numéros et la composition des cellules endocrines dans le pancréas humain adulte varie de plusieurs centaines de milliers à plusieurs millions de gammes de masse et bêta à partir de 500 à 1500 1-3 mg. Avec cette hétérogénéité connue, un traitement standard et procédure de coloration a été développé afin que les régions du pancréas ont été clairement définis et îlots caractérisés par l'histopathologie et rigoureuse des examens immunolocalisation.
Des procédures normalisées pour le traitement de pancréas humain récupéré à partir de donneurs d'organes sont décrites dans la partie 1 de cette série. Le pancréas est transformé en 3 grandes régions (tête, corps, queue), suivis par les sections transversales. Des coupes transversales de la tête du pancréas sont encore divisés, comme indiqué sur la base de la taille, et numérotées par ordre alphabétique pour désigner paragraphes. Cette standardisation permet une analyse complète de la section transversale de la région de la tête, y compris la région unciforme qui contient des îlots composésprincipalement de cellules pancréatiques polypeptidiques à la région de la queue.
Le présent rapport comprend une partie 2 de cette série et décrit les procédures utilisées pour les coupes sériées et la caractérisation histopathologique des coupes en paraffine pancréatiques en mettant l'accent sur les cellules endocrines des îlots de Langerhans, la réplication et de cellules T des infiltrats. Pathologie des sections du pancréas est destiné à caractériser à la fois exocrine, ductulaire, et composants du système endocrinien. Le compartiment exocrine est évalué pour détecter la présence de la pancréatite (actif ou chronique), l'atrophie, la fibrose, et la graisse, ainsi que le système de conduits, en particulier en relation avec la présence d'une néoplasie pancréatique intracanalaire 4. Les îlots sont évalués pour la morphologie, la taille et la densité, les cellules endocrines, l'inflammation, la fibrose, l'amyloïde, et la présence de cellules en réplication ou apoptotiques en utilisant H & E et les taches IHC.
Le dernier élément décrit dans la partie 2 est la disposition de la lame colorées comme images numérisées de diapositives entières. Les diapositives numérisées sont organisées au cas par cas et dans la région du pancréas dans une base de données en ligne la création d'une pathologie virtuelle biobanque. L'accès à cette collection en ligne est actuellement fourni à plus de 200 cliniciens et les scientifiques impliqués dans la recherche du diabète de type 1. La base de données en ligne fournit un moyen de partage des données rapide et complète et pour les enquêteurs de sélectionner des blocs de paraffine ou congelés pour des coupes sériées.
Protocol
Discussion
Normalisation des procédures IHC est critique pour l'analyse d'image, en particulier lors de l'utilisation des algorithmes informatiques, à travers un grand nombre de diapositives au fil du temps. La procédure de coloration IHC décrit dans le présent rapport permettront d'analyser des échantillons de lots d'un donateur donné de l'aide d'un Autostainer au sein d'une journée de travail de 8 heures et sont modifiées à partir d'un précédent rapport 5. Images numéri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier les familles des donneurs et des d'approvisionnement en organes impliqués dans cette recherche et Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, Agarwal et Roshan pour leur aide d'experts. Ce travail a été financé par la Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) à l'appui du Réseau des donneurs d'organes atteints de diabète pancréatique.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
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