Fargeløsninger Protokoller for Human pancreatic holmer
Summary
Denne videoen viser prosedyrer for karakterisering av humane pankreas holmer med hematoxylin og eosin (H & E) og immunhistokjemi (IHC). Pankreas deler fra hode, kropp og hale regioner er farget av både H & E og IHC å bestemme holmen endokrine sammensetning (insulin, glukagon, og bukspyttkjertelen polypeptid), celle replikering (Ki67) og inflammatoriske infiltrater (H & E, CD3). Den uncinate regionen er lokalisert ved hjelp av IHC for bukspyttkjertelen polypeptid.
Abstract
Estimater av holmen areal og tall og endokrine celle sammensetning i voksent menneske bukspyttkjertelen varierer fra flere hundre tusen til flere millioner og beta masse spenner fra 500 til 1500 mg 1-3. Med dette kjente heterogenitet, ble en standard behandling og farging prosedyre utviklet slik at bukspyttkjertelen regionene var klart definert og holmer karakterisert ved hjelp av strenge histopatologi og immunolocalization undersøkelser.
Standardiserte rutiner for behandling av menneskelige bukspyttkjertelen utvinnes fra organdonorer er beskrevet i del 1 av denne serien. Bukspyttkjertelen er behandlet i 3 hovedområder (hode, kropp, hale) etterfulgt av tverrgående deler. Tverrgående deler fra bukspyttkjertelen hodet er igjen delt, som angitt basert på størrelse, og nummerert alfabetisk å betegne underseksjoner. Denne standardiseringen gir en komplett tverrsnitt analyse av hodet regionen inkludert uncinate regionen som inneholder holmer komponerthovedsakelig av bukspyttkjertelen polypeptid celler til halen regionen.
Den nåværende Rapporten omfatter del to av denne serien, og beskriver prosedyrer som brukes for seriell seksjonering og histopatologisk karakterisering av pancreatic parafinsnitt med en vekt på holmen endokrine celler, replikering og T-celle infiltrater. Pathology av pankreas seksjoner er ment å karakterisere både eksokrin, ductular, og endokrine komponenter. Exocrine rommet er evaluert for tilstedeværelse av pankreatitt (aktiv eller kronisk), atrofi, fibrose, og fett, samt kanalsystemet, spesielt i forhold til tilstedeværelse av pankreas intraductal neoplasi 4. Holmene er evaluert for morfologi, størrelse og tetthet, endokrine celler, betennelse, fibrose, amyloid, og tilstedeværelsen av replikere eller apoptotisk celler ved hjelp av H & E og IHC flekker.
Den siste komponenten er beskrevet i del 2 er bestemmelsen av de fargede lysbildets som digitaliserte hele lysbildene. De digitaliserte lysbilder organiseres av saken og bukspyttkjertel region i en online patologi database skape en virtuell biobank. Tilgang til denne elektroniske samlingen er for tiden til over 200 klinikere og forskere er involvert i type 1 diabetes forskning. Den elektroniske databasen gir et middel for rask og fullstendig deling av data og for etterforskerne å velge blokker for parafin eller frosne seriesnitt.
Protocol
Discussion
Standardisering av IHC prosedyrer er kritisk for bildeanalyse, spesielt når du bruker PC-baserte algoritmer over store mengder lysbilder over tid. IHC farging fremgangsmåten som er beskrevet i denne rapporten vil tillate batch analyse av en gitt donor prøver ved hjelp av en autostainer innenfor en 8-timers arbeidsdag og blir endret fra et tidligere rapport 5. Digitaliserte hele lysbildene av hver beiset lysbilde gjort tilgjengelig for nPOD-tilknyttede etterforskerne gjennom web-baserte online patologi syst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker givernes familiene og orgelet innkjøpsorganisasjoner involvert i denne forskningen og Emily Montgomery, Robert Pietras, Ann Fu, Mitali Agarwal, og Roshan Agarwal for sin eksperthjelp. Dette arbeidet ble finansiert av Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T.) i støtte av Nettverk for Bukspyttkjertelen organdonorer med diabetes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 30% Hydrogen Peroxide (H2O2) | FisherScientific | H325-500 | Endogenous peroxidase blocking |
| ABC-Alkaline Phosphatase (AP) | Vector | AK-5000 | AP conjugate |
| Antibody Diluent | Invitrogen | 003218 | Primary antibody |
| Avidin blocker | Vector | SP-2001 | Block endogenous biotin |
| Biotinylated Goat anti-guinea pig | Vector | BA-7000 | Secondary antibody |
| Bluing Reagent | FisherScientific | 7301 | Leica autostainer |
| Citrate buffer, pH 6.0 | BioGenex | HK086-9K | Antigen retrieval |
| Clarifier 1 | FisherScientific | 7401 | Leica autostainer |
| Cytoseal XYL | FisherScientific | 8312-4 | Coverslip mountant |
| DAB | Vector | SK-4100 | HRP chromogen |
| DEEB | DAKO | S2003 | Endogenous AP blocking reagent |
| Eosin Y Alcoholic | FisherScientific | 71204 | Leica autostainer |
| Ethanols- 100%, 95%, 90%, 70% | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
| Hematoxylin | DAKO | S3301 | Dako autostainer |
| Hematoxylin 7211 | FisherScientific | 7211 | Leica autostainer |
| IgG (all host species for primary antibodies) | Various | Various | Negative controls for primaries |
| Liquid Permanent Red (LPR) | DAKO | K0640 | AP chromogen |
| Mach2 AP | Biocare Medical | MALP521L | Goat anti-Mouse AP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | MHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Mach2 HRP | Biocare Medical | RHRP520L | Goat anti-Mouse HRP conjugate |
| Methanol | FisherScientific | Various | H2O2 diluent |
| Normal goat serum | Vector | S-1000 | IHC blocking reagent |
| Sniper | Biocare Medical | BS966M | IHC blocking reagent |
| TBST 20X | ThermoScientific | TA-999-TT | IHC buffer |
| Triology 20x | Cell Marque | 920P-06 | Antigen Retrieval |
| Xylene | FisherScientific | Various | Deparaffinization and coverslipping |
Table 1. Specific reagents.
| Primary Antibody | Host species | Vendor | Cat. # | Comments and Antigen Retrieval |
| Paraffin | ||||
| Amylase | Mouse | Santa Cruz | SC-46657 | Citrate |
| Amylin | Mouse | Serotec | MCA11267 | Citrate |
| Carbonic anhydrase 19.9 | Mouse | Abcam | ab15146 | |
| Caspase-3, cleaved | Rabbit | Cell Signaling | 9961 | Citrate or Trilogy |
| CD20 | Mouse | DAKO | M0755 | Citrate or Trilogy |
| CD3 | Rabbit | DAKO | A0452 | Citrate |
| CD34 | Mouse | Cell Signaling | 3569 | Citrate |
| CD4 | Mouse | DAKO | M7310 | Citrate |
| CD45 | Mouse | DAKO | M0754 | Citrate |
| CD68 | Mouse | DAKO | M0876 | Citrate |
| CD8 | Mouse | DAKO | M7103 | Citrate |
| Chromogranin A | Rabbit | DAKO | A0430 | Citrate |
| CK17 | Mouse | DAKO | M7046 | Citrate |
| CK19 | Mouse | DAKO | M0772 | Citrate |
| CK7 | Mouse | DAKO | M7018 | Citrate |
| C-peptide | Rabbit | Cell Signaling | 4593 | Citrate |
| Foxp3 | Rat | e Bioscience | 14-4776-80 | Citrate |
| Ghrelin | Goat | Santa Cruz | SC-10386 | |
| Ghrelin | Rabbit | Abcam | ab85104 | |
| Glucagon | Rabbit | DAKO | A0565 | |
| Glucagon | Mouse | Abcam | ab10988 | Citrate |
| Glucagon | Guinea Pig | Bachem | T-5037 | Citrate |
| Glut-1 | Mouse | Abcam | ab40084 | Trilogy |
| Glut-2 | Rabbit | Santa Cruz | SC-9117 | Not expressed in human islets |
| Insulin | Guinea Pig | DAKO | A0564 | |
| Ki-67 | Mouse | DAKO | M7240 | Citrate |
| Mafa | Rabbit | Novus Biological | NB400-137A | Trilogy |
| Pancreatic polypeptide | Rabbit | Invitrogen | 18-0043 | Citrate |
| Pdx-1 | Guinea Pig | Abcam | ab47308 | Citrate or Trilogy |
| Proinsulin | Mouse | Novocastra | NCL-proin-1G4 | |
| Proinsulin | Mouse | Developmental Studies Hybridoma Bank | GS-9A8 | Citrate |
| Secretagogin | Rabbit | Sigma | HPA 006641 | Citrate |
| Smooth muscle actin | Rabbit | Abcam | ab5694 | |
| Somatostatin | Rabbit | DAKO | A0566 | |
| Synaptophysin | Mouse | DAKO | M0776 | Citrate |
| Fresh Frozen | Host species | Vendor | Cat. # | Comments |
| CD11b | Rat | Abcam | ab6332 | Fix with 4% PF |
| CD11c | Rabbit | Serotec | AHP1226 | |
| CD25 | Mouse | Novus Biological | NB 600-564 | Use overnight incubation for paraffin sections |
| CD94 | Mouse | Abcam | ab61874 | Fix with acetone |
| GAD65 | Mouse | Santa Cruz | SC-130569 | Fix with 4% PF |
| HLA-ABC | Mouse | DAKO | M0736 | Fix with acetone or 4% PF |
Table 2. Primary antibodies.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Aperio Scanscope CS | Aperio | Digital slide scanner | |
| DAKO Autostainer Plus | DAKO | IHC stains | |
| Label Matrix printing software | BioCarta | LM7UP57 | Slide label software |
| Leica XL Autostainer | Leica | H&E stains | |
| Premium Coverglass | FisherScientific | 12-548-5J | Coverslip |
| Spectrum Information Manager | Aperio | Scanner software | |
| Superfrost Plus slides | FisherScientific | 12-550-15 | Positively charged slides |
| Vegetable steamer | Black and Decker | Various | Antigen retrieval |
| Zebra TLP 3742 | CDWG | TLP3742 | Slide label printer |
Table 3. Specific supplies and equipment.
References
- In’t Veld, P., Marichal, M. Microscopic anatomy of the human islet of Langerhans. Adv. Exp. Med. Biol. 654, 1-19 (2010).
- Matveyenko, A. V., Butler, P. C. Relationship between beta-cell mass and diabetes onset. Diabetes Obes. Metab. 10, 23-31 (2008).
- Saisho, Y. Pancreas volumes in humans from birth to age one hundred taking into account sex, obesity, and presence of type-2 diabetes. Clin. Anat. 20, 933-942 (2007).
- Hruban, R. H. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am. J. Surg. Pathol. 25, 579-586 (2001).
- Campbell-Thompson, M. Pancreatic adenocarcinoma patients with localised chronic severe pancreatitis show an increased number of single beta cells, without alterations in fractional insulin area. Diabetologia. 52, 262-270 (2009).
- Meier, J. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57, 1584-1594 (2008).
- Rowe, P. A., Campbell-Thompson, M. L., Schatz, D. A., Atkinson, M. A. The pancreas in human type 1 diabetes. Semin. Immunopathol. 33, 29-43 (2011).
- Veld, I. n. ‘. t., P, . Insulitis in human type 1 diabetes: The quest for an elusive lesion. Islets. 3, 131-138 (2011).
- van Belle, T. L., Coppieters, K. T., von Herrath, M. G. Type 1 diabetes: etiology, immunology, and therapeutic strategies. Physiol Rev. 91, 79-118 (2011).
