Échantillonnage humaines Peptidome salive autochtones l'aide d'une sonde d'ultrafiltration Lollipop-Like: Simplifier et améliorer la détection des peptides pour spectrométrie de masse clinique
Summary
Considérant la salive d'échantillonnage pour l'application clinique future, une sucette en forme de l'ultrafiltration (LLUF) sonde a été fabriquée pour s'adapter à la cavité buccale humaine. Une analyse directe de la salive non digérés par NanoLC-spectrométrie de masse LTQ a démontré la capacité de sondes LLUF pour éliminer les protéines et les protéines de grandes abondance élevés, et de faire peu abondantes peptides plus détectable.
Abstract
Bien que la salive humaine protéome et peptidome ont été révélés 1-2 ils ont été identifiés à partir de majorly digestion trypsique de protéines de la salive. Identification des peptidome indigène de la salive humaine sans digestion préalable avec des enzymes exogènes devient impératif, puisque peptides natifs dans la salive humaine fournir des valeurs possibles pour le diagnostic de la maladie, prédire l'évolution de la maladie, et le suivi de l'efficacité thérapeutique. D'échantillonnage approprié est une étape critique pour l'amélioration de l'identification de la salive humaine peptidome indigène. Les méthodes traditionnelles d'échantillonnage salive humaine impliquant centrifugation pour éliminer les débris 3-4 peut-être trop de temps pour être applicable pour une utilisation clinique. En outre, l'enlèvement des débris par centrifugation peut être incapable de nettoyer la plupart des agents pathogènes infectées et éliminer les protéines d'abondance élevés qui entravent souvent l'identification des peptidome faible abondance.
Les approches conventionnelles protéomiques qui pritiellement utiliser électrophorèse sur gel bidimensionnelle (2-DE) des gels de conjugaison avec la digestion dans le gel sont capables d'identifier plusieurs protéines salivaires 5-6. Cependant, cette approche n'est généralement pas suffisamment sensibles pour détecter des peptides ou protéines de faible abondance. Chromatographie en phase liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) à base de protéomique est une alternative qui permet d'identifier des protéines sans l'accord préalable 2-DE séparation. Bien que cette approche offre une plus grande sensibilité, il a généralement besoin d'échantillon avant de pré-fractionnement 7 et pré-digestion avec la trypsine, ce qui rend difficile pour un usage clinique.
Pour contourner l'obstacle en spectrométrie de masse en raison de la préparation des échantillons, nous avons développé une technique appelée ultrafiltration capillaire (CUF) sondes 8-11. Les données de notre laboratoire ont démontré que les sondes du CUF sont capables de capturer des protéines in vivo à partir des micro-environnements différents chez les animaux d'une manière dynamique et minimalement invasive 8 –11. Pas de centrifugation est nécessaire, car une pression négative est créée par un simple retrait de la seringue lors de la collecte de l'échantillon. Les sondes du CUF combinés avec LC-MS ont réussi à identifier des protéines tryptique-digérés 8-11. Dans cette étude, nous avons amélioré la technique d'échantillonnage d'ultrafiltration en créant une sucette en forme de l'ultrafiltration (LLUF) sonde qui peut facilement se glisser dans la cavité buccale humaine. L'analyse directe par LC-MS, sans digestion par la trypsine ont montré que la salive humaine contient localement des fragments peptidiques de nombreux dérivés de protéines différentes. L'échantillonnage de salive avec des sondes LLUF éviter une centrifugation mais efficacement éliminé de nombreuses protéines abondance grandes et hautes. Nos résultats de spectrométrie de masse a démontré que de nombreux peptides de faible abondance est devenue détectable après filtrage des plus grosses protéines avec des sondes LLUF. Détection des peptides de faible abondance de salive était indépendante de la séparation des échantillons en plusieurs étapes avec la chromatographie. Pour l'application clinique, les sondes LLUF incorporerd avec LC-MS pourrait être utilisé à l'avenir pour surveiller la progression de la maladie de la salive.
Protocol
Discussion
Nous avons constaté que de nombreux fragments peptidiques existent dans la salive humaine non digérée. Ces fragments peptidiques sont des dérivés de diverses formes de protéines riches en proline, l'actine, alpha amylase, globine alpha 1, bêta globine, histain 1, la kératine 1, la mucine 7, récepteur d'immunoglobuline polymérique, satherin, S100A9. Il pourrait y avoir de nombreux facteurs qui contribuent à la production de peptides avec des sites de clivage indéterminées. Par exemple, certains fragm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health des subventions (R01-AI067395-01, R21-R022754-01, et R21-I58002-01). Nous remercions C. Niemeyer pour la lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
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