Probenahme menschliche Speichel Indigene Peptidoms Mit einem Lollipop-Like Ultrafiltration Sonde: vereinfachen und erweitern Peptid-Erkennung für Klinische Massenspektrometrie
Summary
Angesichts Speichel Probenahme für zukünftige klinische Anwendung wurde ein Lollipop-ähnliche Ultrafiltration (LLUF) Sonde hergestellt, um in die menschliche Mundhöhle passen. Direkte Analyse von unverdauten Speichel mit nanoLC-LTQ Massenspektrometrie zeigten die Fähigkeit von LLUF Sonden, um große Proteine und hohe Abundanz Proteine zu entfernen, und machen Low-reiche Peptide mehr nachweisbar.
Abstract
Obwohl menschlichen Speichel Proteom-und Peptidoms worden 1-2 offenbart haben sie majorly von tryptischen Verdaus von Speichel-Proteine identifiziert. Identifizierung von indigenen Peptidoms von menschlichem Speichel ohne vorherige Spaltung mit exogenen Enzyme wird aber notwendig, da nativen Peptide im menschlichen Speichel mögliche Werte stellen für die Diagnose von Krankheiten, die Vorhersage Fortschreiten der Erkrankung sowie die Überwachung therapeutische Wirksamkeit. Entsprechende Probenahme ist ein wichtiger Schritt für die Verbesserung der Identifikation der menschlichen Speichel indigenen Peptidoms. Traditionelle Methoden der Probenahme menschlichen Speichel mit Zentrifugation, um Verschmutzungen zu entfernen 4.3 kann zu zeitaufwendig anwendbar zu sein für den klinischen Einsatz. Darüber hinaus kann Müllbeseitigung durch Zentrifugation nicht in der Lage, die meisten der infizierten Krankheitserregern reinigen und entfernen Sie die hohe Abundanz Proteine, die oft behindern die Identifikation von geringer Menge Peptidoms.
Herkömmliche Ansätze Proteomik, dass priLinie nutzen zweidimensionale Gelelektrophorese (2-DE Gelen) in Konjugation mit in-Gel-Verdau, imstande sind, viele Proteine Speichel 5-6. Allerdings ist dieser Ansatz im Allgemeinen nicht ausreichend empfindlich gegenüber niedrigen Häufigkeit Peptide / Proteine zu detektieren. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) basierten Proteomik ist eine Alternative, die Proteine ohne vorherige 2-DE Trennung identifizieren können. Obwohl dieser Ansatz bietet eine höhere Empfindlichkeit, muss es in der Regel vor Proben-Fraktionierung 7 und vor dem Verdau mit Trypsin, was es schwierig für den klinischen Gebrauch macht.
Um das Hindernis in der Massenspektrometrie durch Probenvorbereitung zu umgehen, haben wir eine Technik, die als Kapillare Ultrafiltration (CUF) Sonden 8-11 entwickelt. Daten aus unserem Labor gezeigt, dass die Sonden, die CUF Erfassung Proteine in vivo aus verschiedenen Mikroumgebungen bei Tieren in einem dynamischen und minimal invasiven Weise 8 –11. Keine Zentrifugation ist notwendig, da ein Unterdruck durch einfaches Herausziehen Spritze während der Probenahme erstellt wird. Die CUF-Sonden mit LC-MS kombiniert erfolgreich identifizierten tryptischen-verdaute Proteine 11.08. In dieser Studie wurden aufgerüstet wir die Ultrafiltration Sampling-Technik, indem sie einen Lutscher-wie Ultrafiltration (LLUF) Sonde, die sich leicht in die menschliche Mundhöhle kann passen. Die direkte Analyse mittels LC-MS ohne Trypsin-Verdau zeigte, dass menschliche Speichel enthält viele indigenously Peptidfragmente aus verschiedenen Proteinen abgeleitet sind. Probenahme mit Speichel LLUF Sonden vermieden Zentrifugation aber effektiv entfernt viele größere und hohe Abundanz Proteine. Unsere massenspektrometrischen Ergebnisse dargestellt, dass viele geringer Menge nachweisbar Peptide nach Herausfiltern von größeren Proteinen mit LLUF Sonden wurde. Erkennung von Peptiden geringer Menge Speichel war unabhängig von mehrstufigen Stichprobe Trennung mit Chromatographie. Für die klinische Anwendung, verfügen die Sonden LLUFd mit LC-MS könnte möglicherweise in der Zukunft genutzt werden, um den Krankheitsverlauf aus Speichel zu überwachen.
Protocol
Discussion
Wir haben festgestellt, dass viele Peptidfragmente in menschlichen unverdaute Speichel abgegeben. Diese Peptidfragmente sind Derivate aus verschiedenen Formen von Prolin-reiche Proteine, Actin, alpha-Amylase, Alpha-1-Globin, beta-Globin, histain 1, Keratin 1, Muzin 7, polymeren Immunglobulin-Rezeptor, satherin, S100A9. Es könnte viele Faktoren, die die Produktion von Peptiden mit ungeklärter Spaltstellen sein. Zum Beispiel können einige Peptidfragmente natürlich vorhanden sein in menschlichem Gesamtblut Speichel. Vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 und R21-I58002-01) unterstützt. Wir danken C. Niemeyer für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
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