Bir Lollipop-Like Ultrafiltrasyon Probe Kullanımı İnsan Yerli Tükürük Peptidome Örnekleme: Klinik Kütle Spektrometresi için Peptid Algılama basitleştirin ve geliştirin
Summary
Gelecekteki klinik uygulama için tükürük örnekleme göz önüne alındığında, bir lolipop gibi ultrafiltrasyon (LLUF) prob insan oral kavite sığacak şekilde imal edilmiştir. NanoLC-LTQ kütle spektrometresi tarafından sindirilmemiş tükürük Direkt analizi büyük proteinler ve yüksek bolluk proteinler kaldırmak ve düşük bol peptidler daha tespit yapmak LLUF probların yeteneğini göstermiştir.
Abstract
Insan tükürük proteom ve peptidome 1-2 ortaya sürülmüş olsa da onlar majorly triptik tükürük proteinleri sindirir identifiye edildi. Insan tükürük yerli peptidler, hastalığın tanısında hastalığın ilerlemesini tahminde ve terapötik etkinlik izlenmesi için potansiyel değerlerini sağlamak yana eksojen enzimler ile önceden sindirim olmadan insan tükürük yerli peptidome belirlenmesi, önem kazanmaktadır. Uygun örnekleme insan yerli tükürük peptidome belirlenmesi geliştirilmesi için önemli bir adımdır. 3-4 enkaz kaldırmak için santrifüj içeren insan tükürük örnekleme Geleneksel yöntemler çok zaman alıcı klinik kullanım için geçerli olması olabilir. Ayrıca, santrifüj enkaz kaldırma enfekte patojenlerin en temiz ve genellikle düşük bolluk peptidome belirlenmesine engel yüksek bolluk proteinleri kaldırmak mümkün olabilir.
Konvansiyonel proteomik yaklaşımlar priin-jel sindirim ile konjugasyon Marily kullanan iki boyutlu jel elektroforezi (2-DE) jeller birçok tükürük proteinleri 5-6 belirleme yeteneğine sahiptirler. Ancak, bu yaklaşım genellikle düşük bolluk peptid / protein tespit etmek için yeterince duyarlı değildir. Sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi (LC-MS) tabanlı proteomik önce 2-DE ayrımı olmadan proteinler tespit edebilir bir alternatiftir. Bu yaklaşım, yüksek hassasiyeti sağlasa da, genel olarak önceden Örnek ön-fraksiyonasyon 7 ve zor bir hale getirir klinik kullanım için tripsin ile ön-sindirim ihtiyacı vardır.
Numune hazırlama nedeniyle kütle spektrometresi de engel aşmak için, kılcal ultrafiltrasyon (CUF) probları 8-11 denen bir teknik geliştirdik. Laboratuvar verileri CUF probları dinamik ve minimal invaziv şekilde 8 hayvanlarda çeşitli mikro gelen in vivo protein yakalama yeteneğine sahip olduğunu gösterdi –11. Negatif basınç numune alma sırasında çekilerek sadece şırınga ile oluşturulan bu yana hiçbir santrifüj gereklidir. LC-MS ile birlikte CUF probları başarıyla triptik-sindirilmiş protein 8-11 belirledik. Bu çalışmada, kolaylıkla insan oral kavite sığabilecek bir lolipop benzeri ultrafiltrasyon (LLUF) prob oluşturarak ultrafiltrasyon örnekleme tekniği yükseltti. Tripsin sindirim olmaksızın LC-MS ile doğrudan analizi keşif sahasında insan tükürük çeşitli proteinlerin elde edilen pek çok peptid fragmanları içerir gösterdi. LLUF problar ile tükürük Örnekleme santrifüj kaçınılması ama etkili birçok büyük ve yüksek bolluk proteinler kaldırıldı. Bizim kitle spektrometrik sonuçlar çok düşük bolluk peptitler LLUF problar ile daha büyük proteinler filtreleyerek sonra saptanabilir hale geldiği gösterilmiştir. Düşük bolluk tükürük peptidlerin Algılama kromatografisi ile birden fazla adım örnek ayrılması bağımsız oldu. Klinik uygulama için, LLUF probları dahilLC-MS ile d potansiyel tükürük hastalığın ilerlemesini izlemek için gelecekte kullanılabilir.
Protocol
Discussion
Biz pek çok peptid fragmanları insan sindirilmemiş tükürük var olduğunu bulduk. Bunlar, peptit parçaları prolin-zengin proteinler, aktin, alfa amilaz, alfa 1 globin, beta globin, histain 1, keratin 1, musin 7, polimerik immünoglobulin reseptörü, satherin, S100A9 çeşitli formları arasından türevleridir. Saptanmamış yarılma bölgeleri olan peptitler üretimine katkıda bulunan bir çok faktör var olabilir. Örneğin bazı peptit parçaları insan tam tükürük doğal olarak mevcut olabilir. C-termini…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Sağlık Hibeler National Institutes (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 ve R21-I58002-01) tarafından desteklenmiştir. Biz yazının eleştirel okuma C. Niemeyer teşekkür ederim.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
