Provtagning Human Indigenous Saliv Peptidome Med en Lollipop-Like Ultrafiltrering Probe: förenkla och förbättra peptid Detection för klinisk Mass Spectrometry
Summary
Med tanke på saliv provtagning för framtida klinisk tillämpning, var en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond tillverkas för att passa i den mänskliga munhålan. Direkt analys av osmält saliv genom NanoLC-LTQ masspektrometri visade förmågan hos LLUF prober för att avlägsna stora proteiner och höga proteiner överflöd, och gör låg rikliga peptider mer detekterbar.
Abstract
Även om mänsklig saliv proteom och peptidome har avslöjat 1-2 de majorly identifieras tryptiska digereringar av saliv proteiner. Identifiering av inhemska peptidome i mänsklig saliv utan föregående uppslutning med exogena enzymer blir absolut nödvändigt, eftersom infödda peptider i mänsklig saliv ge potentiella värden för att diagnostisera sjukdomar, förutsäga sjukdomsutveckling och övervakning terapeutisk effekt. Lämplig provtagning är ett kritiskt steg för förbättring av identifiering av mänskligt inhemska saliv peptidome. Traditionella metoder för provtagning mänsklig saliv innebär centrifugering för att avlägsna skräp 3-4 kan vara för tidskrävande att gälla för klinisk användning. Dessutom kan skräp avlägsnas genom centrifugering inte att rengöra de flesta av de smittade patogener och ta bort de höga överflöd proteiner som ofta hindrar identifiering av låg förekomst peptidome.
Konventionella proteomik metoder som främstligen använda två-dimensionell gelelektrofores (2-DE) geler i konjugation med i-gel-digerering är i stånd att identifiera många saliv proteiner 5-6. Emellertid är denna metod i allmänhet inte tillräckligt känsligt för att detektera låga förekomst peptider / proteiner. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) proteomik är ett alternativ som kan identifiera proteiner utan föregående 2-DE-separation. Även om detta tillvägagångssätt tillhandahåller högre känslighet, behöver den i allmänhet före provet före fraktionering 7 och pre-nedbrytning med trypsin, vilket gör det svårt för klinisk användning.
Att kringgå hinder i masspektrometri på grund av provberedning, har vi utvecklat en teknik som kallas kapillär ultrafiltrering (CUF) sonder 8-11. Data från vårt laboratorium visat att de CUF sonderna har förmåga att fånga proteiner in vivo från olika mikromiljöer i djur i en dynamisk och minimalt invasiva sätt 8 –11. Ingen centrifugering är nödvändig eftersom ett undertryck skapas genom att helt enkelt spruta dra under provtagning. De CUF sonderna kombination med LC-MS har lyckats identifierat tryptisk-nedbrutna proteiner 8-11. I denna studie uppgraderade vi tekniken ultrafiltrering provtagning genom att skapa en klubba-liknande ultrafiltrering (LLUF) sond som lätt får plats i den mänskliga munhålan. Den direkta analysen genom LC-MS utan trypsin-digerering visade att human saliv utvinning innehåller många peptidfragment härstammande från olika proteiner. Provtagning saliv med LLUF sonder undvikas centrifugering men effektivt bort många större och hög förekomst proteiner. Våra masspektrometriska resultat visade att många låg förekomst peptider blev detekterbar efter att filtrera bort större proteiner med LLUF sonder. Detektering av låga peptider överflöd saliv var oberoende av flera steg prov separation med kromatografi. För klinisk tillämpning av LLUF sonderna införlivad med LC-MS skulle kunna användas i framtiden för att följa sjukdomens progression från saliv.
Protocol
Discussion
Vi har funnit att många peptidfragment existera i human saliv osmält. Dessa peptidfragment är derivat från olika former av prolinrika proteiner, aktin, a-amylas, alfa 1-globin, p-globin, histain 1, keratin 1, mucin 7, polymeriska immunglobulinreceptorn, satherin, S100A9. Det kan finnas många faktorer som bidrar till produktion av peptider med obestämda klyvningsställen. Till exempel kan vissa peptidfragment vara naturligt närvarande i humant helblod saliv. Många peptider med PQ C-terminalerna identifierades <st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag (R01-AI067395-01, R21-R022754-01 och R21-I58002-01). Vi tackar C. Niemeyer för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Polyethersulfone membranes | Pall Corporation | 30 kDa MWCO | |
| Teflon fluorinated ethylene propylene tube | Upchurch Scientific | ||
| Blue dextran | Sigma | ||
| Nano LC system | Eksigent | ||
| C18 trap column | Agilent | 5065-9913 | |
| LTQ linear ion-trap mass spectrometer | Thermo Fisher | ||
| Sorcerer 2 | Sage-N Research | ||
| Acetonitrile-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9832-03 | LC/MS grade |
| Water-0.1% formic acid | J.T. Baker | 9834-03 | LC/MS grade |
References
- Denny, P. The proteomes of human parotid and ubmandibular/sublingual gland salivas collected as the ductal secretions. J. Proteome Res. 7, 1994-2006 (2008).
- Hu, S., Loo, J. A., Wong, D. T. Human saliva proteome analysis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1098, 323-329 (2007).
- Ng, D. P., Koh, D., Choo, S. G., Ng, V., Fu, Q. Effect of storage conditions on the extraction of PCR-quality genomic DNA from saliva. Clin. Chim. Acta. 343, 191-194 (2004).
- Wade, S. E. An oral-diffusion-sink device for extended sampling of multiple steroid hormones from saliva. Clin. Chem. 38, 1878-1882 (1992).
- Hu, S. Large-scale identification of proteins in human salivary proteome by liquid chromatography/mass spectrometry and two-dimensional gel electrophoresis-mass spectrometry. Proteomics. 5, 1714-1728 (2005).
- Huang, C. M. Comparative proteomic analysis of human whole saliva. Arch. Oral Biol. 49, 951-962 (2004).
- Guerrier, L., Lomas, L., Boschetti, E. A simplified monobuffer multidimensional chromatography for high-throughput proteome fractionation. J Chromatogr. A. 1073, 25-33 (2005).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. Surfactant sodium lauryl sulfate enhances skin vaccination: molecular characterization via a novel technique using ultrafiltration capillaries and mass spectrometric proteomics. Mol. Cell Proteomics. 5, 523-532 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Kawai, M., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo protein sampling using capillary ultrafiltration semi-permeable hollow fiber and protein identification via mass spectrometry-based proteomics. J. Chromatogr. A. 1109, 144-151 (2006).
- Huang, C. M., Wang, C. C., Barnes, S., Elmets, C. A. In vivo detection of secreted proteins from wounded skin using capillary ultrafiltration probes and mass spectrometric proteomics. Proteomics. 6, 5805-5814 (2006).
- Huang, C. M. Mass spectrometric proteomics profiles of in vivo tumor secretomes: capillary ultrafiltration sampling of regressive tumor masses. Proteomics. 6, 6107-6116 (2006).
- Ahmed, N. An approach to remove albumin for the proteomic analysis of low abundance biomarkers in human serum. Proteomics. 3, 1980-1987 (2006).
- Michishige, F. Effect of saliva collection method on the concentration of protein components in saliva. J. Med. Invest. 53, 140-146 (2006).
- Kruger, C., Breunig, U., Biskupek-Sigwart, J., Dorr, H. G. Problems with salivary 17-hydroxyprogesterone determinations using the Salivette device. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 34, 926-929 (1996).
- Luque-Garcia, J. L., Neubert, T. A. Sample preparation for serum/plasma profiling and biomarker identification by mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1153, 259-276 (2007).
- Ramstrom, M. Depletion of high-abundant proteins in body fluids prior to liquid chromatography fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. J. Proteome. Res. 4, 410-416 (2005).
- Messana, I. Characterization of the human salivary basic proline-rich protein complex by a proteomic approach. J. Proteome. Res. 3, 792-800 (2004).
- Li, T. Possible release of an ArgGlyArgProGln pentapeptide with innate immunity properties from acidic proline-rich proteins by proteolytic activity in commensal streptococcus and actinomyces species. Infect. Immun. 68, 5425-5429 (2000).
- Davtyan, T. K., Manukyan, H. A., Mkrtchyan, N. R., Avetisyan, S. A., Galoyan, A. A. Hypothalamic proline-rich polypeptide is a regulator of oxidative burst in human neutrophils and monocytes. Neuroimmunomodulation. 12, 270-284 (2005).
- Jonsson, A. P. Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).
- Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces. Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).
- Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins. Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).
- Hardt, M. Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry. Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).
- Wilmarth, P. A. Two-dimensional liquid chromatography study of the human whole saliva proteome. J. Proteome Res. 3, 1017-1023 (2004).
- Saitoh, E., Isemura, S., Sanada, K. Complete amino acid sequence of a basic proline-rich peptide, P-D, from human parotid saliva. J. Biochem. 93, 495-502 (1983).
- Slomiany, B. L., Piotrowski, J., Czajkowski, A., Shovlin, F. E., Slomiany, A. Differential expression of salivary mucin bacterial aggregating activity with caries status. Int. J. Biochem. 25, 935-940 (1993).
- Juarez, Z. E., Stinson, M. W. An extracellular protease of Streptococcus gordonii hydrolyzes type IV collagen and collagen analogues. Infect Immun. 67, 271-278 (1999).
- Lo, C. S., Hughes, C. V. Identification and characterization of a protease from Streptococcus oralis C104. Oral Microbiol. Immunol. 11, 181-187 (1996).
- Harrington, D. J., Russell, R. R. Identification and characterisation of two extracellular proteases of Streptococcus mutans. FEMS Microbiol. Lett. 121, 237-241 (1994).
- Huang, C. M. In vivo secretome sampling technology for proteomics. Proteomics Clin. Appl. 1, 953-962 (2007).
- Skepo, M., Linse, P., Arnebrant, T. Coarse-grained modeling of proline rich protein 1 (PRP-1) in bulk solution and adsorbed to a negatively charged surface. J. Phys. Chem. B. 110, 12141-12148 (2006).
- Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations. J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).
- Linhares, M. C., Kissinger, P. T. Pharmacokinetic monitoring in subcutaneous tissue using in vivo capillary ultrafiltration probes. Pharm Res. 10, 598-602 (1993).
- Li, W., Hendrickson, C. L., Emmett, M. R., Marshall, A. G. Identification of intact proteins in mixtures by alternated capillary liquid chromatography electrospray ionization and LC ESI infrared multiphoton dissociation Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 71, 4397-4402 (1999).
- Whitelegge, J. P. Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry. Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).
- Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals. Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).
- Challacombe, S. J., Sweet, S. P. Oral mucosal immunity and HIV infection: current status. Oral Dis. 8, 55-62 (2002).
- Jensen, J. L. Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).
