המחקר הגנטי של הדור הבא אקסון עם נוירונים בתרבית למבוגרים הגנגליון הגב שורש
Summary
<em> במבחנה</em> מודל המחקר הגנטי של התחדשות האקסון שימוש בתרבית עכבר בוגרים הגב שורש עצב הגנגליון מתואר. השיטה כוללת צעד re-suspension/re-plating לאפשר האקסון מחדש הצמיחה מתא עצב שעברו מניפולציה גנטית. גישה זו שימושית במיוחד עבור אובדן של תפקודי מחקרים של התחדשות האקסון באמצעות RNAi מבוסס מציאה חלבון.
Abstract
זה ידוע היטב כי נוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא יכול להתחדש האקסונים שלהם לאחר פציעות עקב היכולת הפנימית פחתה כדי לתמוך בצמיחה האקסון וסביבה עוינת 1,2 CNS בוגרת. לעומת זאת, נוירונים בוגרים במערכת העצבים ההיקפית (PNS) להתחדש בקלות אחרי 3 פציעות. למבוגרים הגב הגנגליון שורש (DRG) נוירונים ידועים להתחדש וחסונה לאחר פציעות עצבים היקפיים. כל תא עצב DRG גדל האקסון 1 מ סומה התא, אילו ענפים לשני סניפים: הסניף axonal היקפי innervating מטרות הפריפריה והסניף המרכזי הרחבת לתוך חוט השדרה. הפציעה של אקסונים היקפיים תוצאות DRG התחדשות האקסון משמעותי, ואילו אקסונים מרכזיות בחוט השדרה להתחדש גרוע לאחר פציעה. עם זאת, אם הפגיעה axonal היקפי מתרחשת לפני הפגיעה בחוט השדרה (תהליך הנקרא הנגע מיזוג), התחדשות של אקסונים המרכזיים הוא greatlY משופרת 4. יתר על כן, אקסונים המרכזיים של נוירונים DRG לשתף את הסביבה העוינת כמו יורד אקסונים corticospinal בחוט השדרה. יחד, ההשערה היא כי המנגנונים המולקולריים השולטים התחדשות האקסון של נוירונים בוגרים DRG ניתן לרתום כדי לשפר את מערכת העצבים המרכזית התחדשות האקסון. כתוצאה מכך, מבוגרים נוירונים DRG כיום שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד הצמיחה האקסון משובי 5-7.
כאן אנו מתארים את השיטה של תרבות המבוגרים נוירון DRG, שניתן להשתמש בהם למחקר הגנטי של התחדשות האקסון במבחנה. ב הבוגרת מודל זה נוירונים DRG הם מניפולציה גנטית דרך transfection-electroporation בתיווך גן 6,8. על ידי transfecting נוירונים עם ה-DNA פלסמיד או סי / shRNA, גישה זו מאפשרת הן של רווח והפסד של תפקודי ניסויים כדי לבדוק את תפקידו של כל עניין הגנים של בצמיחה האקסון מתא עצב DRG בוגרים. כאשר נוירונים הם transfected עם סי / shRNA, חלבון אנדוגני הוא ממוקדמרוקנת בדרך כלל לאחר 3-4 ימים בתרבות, במהלכם צמיחה איתנה זמן האקסון כבר התרחש, מה שהופך את ההפסד של תפקודי מחקרים פחות יעיל. כדי לפתור בעיה זו, השיטה המתוארת כאן כוללת צעד מחדש ההשעיה מחדש ציפוי לאחר transfection, המאפשר אקסונים מחדש לגדול מ נוירונים בהעדר חלבון מטרה. לבסוף, אנו מספקים דוגמה של שימוש במודל חוץ גופית כדי ללמוד את התפקיד של גנים הקשורים התחדשות האקסון, C-יוני, בתיווך הצמיחה של האקסון למבוגרים DRG נוירונים 9.
Protocol
Discussion
למבוגרים נוירונים DRG להתחדש האקסונים שלהם וחסונה לאחר פגיעה עצבית היקפית in vivo ו – in vitro, ובכך לספק מערכת שימושית ללמוד התחדשות האקסון אצל בעלי חיים בוגרים. בתרבות חוץ גופית של נוירונים בוגרים DRG נעשה שימוש נרחב בשיטה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של FZ-NIH (R01NS064288) ואת ה 'קרייג Neilsen קרן.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 |
| Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
