Summary

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

Published: August 17, 2012
doi:

Summary

<em> 체외에서</em교양 성인 마우스 지느러미 루트 신경절의 신경 세포를 사용하여 축삭 재생의 유전자 연구> 모델이 설명되어 있습니다. 방법은 유전자 조작을받은 뉴런의 축삭의 재 성장을 허용하는 re-suspension/re-plating 단계를 포함합니다. 이 방법은 RNAi 기반의 단백질 분해를 사용하여 축삭 재생의 손실 기능 연구에 특히 유용합니다.

Abstract

이곳은 중추 신경계 (CNS)에서 성숙한 뉴런이 성숙 CNS의 1,2의 축삭의 성장과 적대적인 환경을 지원하는 줄었 본질적인 기능으로 인해 부상 후 자신의 axons을 다시 생성 수 없다고 알려져있다. 반대로, 말초 신경 계통의 성숙한 뉴런 (PNS)는 부상 3 후 즉시 재생. 성인 지느러미 루트 신경절 (DRG) 뉴런이 잘 말초 신경 부상 후 robustly 재생하는 것으로 알려져 있습니다. 주변 목표 및 척수쪽으로 뻗어 있고 중앙 지점 innervating 말초 지점 : 각 DRG 신경 세포는 세포 소마의 어느 지점이 axonal 가지로 하나 축삭을 자랍니다. 실질적인 축삭 재생의 DRG 주변 axons 결과의 부상은 척수 중앙 axons 반면 부상 이후 저조한 재생. 주변 axonal 부상 척수 부상 (프로세스 조절 장애라고도 함), 중앙 axons의 중생 이전에 발생하는 경우에는 greatl입니다y는 4 개선. 또한, DRG 뉴런의 중심 axons은 척수에 corticospinal의 axons 내림차순 같은 적대적인 환경을 공유할 수 있습니다. 함께, 그것은 성인 DRG의 신경 세포의 축삭 재생을 제어하는​​ 분자 메커니즘은 CNS의 축삭 재생을 향상시키기 위해 무력화 할 수있는 가상있다. 그 결과, 성인 DRG의 뉴런은 현재 폭넓게 재생 축삭의 성장은 5-7 공부를 모델 시스템으로 사용됩니다.

여기에서 우리는 체외에서 축삭 재생의 유전 연구에 사용할 수있는 성인 DRG 신경 세포 문화의 방법을 설명합니다. 이 모델의 성인에서는 DRG의 신경 세포는 유전자 electroporation-매개 유전자 transfection 6,8 통해 조작됩니다. DNA를 플라스미드 또는시 / shRNA, 이러한 방식은 성인 DRG의 뉴런의 축삭의 성장에있는 유전자의 이익의 역할을 조사하기 위해 모두 이득과 손실 함수 실험을 수있는 뉴런을 transfecting함으로써. 뉴런은시 / shRNA으로 transfected 때, 타겟 내생 단백질입니다일반적으로 손실 기능 연구가 덜 효과​​적으로 만드는, 시간 강력한 축삭의 성장 이미 문제가 발생한 기간 동안 문화 3-4일, 후에 고갈. 이 문제를 해결하기 위해서 여기 설명한 방법은 axons가 타겟 단백질의 부재에있는 뉴런에서 다시 성장할 수 있도록 transfection 후 다시 중지하고 다시 도금 단계가 포함되어 있습니다. 마지막으로, 우리는 성인 DRG 뉴런 9 축삭의 성장을 중재로 축삭 재생 – 관련 유전자, C-6월의 역할을 공부 체외 모델에서 이것을 사용하는 예제를 제공합니다.

Protocol

1. Coverslips, 문화 매체, 및 소화 효소의 작성 12-mm 라운드 # 1 유리 coverslips이의 연결을 문화를 위해 사용됩니다. 10 % HCL은 하룻밤 사이에 3 회 (20 분 / 시간)에 증류수와 탈이온수와 초음파 세척을 다음과 coverslips가 청소됩니다. 청소 coverslips는 향후 사용을위한 70 %의 에탄올에 저장됩니다. 각 실험 전에 coverslips는 공기가 문화 판으로 건조와 배치됩니다. 코트에 마른 coverslips, 100 μg / ML…

Discussion

성인 DRG의 뉴런 이렇게 어른 동물로 축삭 재생을 연구하는 유용한 시스템을 제공 robustly 생체내 및 시험 관내에서 말초 신경 손상 후 자신의 axons을 다시 생성. 성인 DRG의 신경 세포의 체외 배양에서 분자 메커니즘을 조사하기 위해 널리 사용되는 방법이되고있는 작품 축삭 재생이 규제된다. culturing 성인 마우스 DRG 뉴런의 체외 프로 시저에 현재 재생 축삭 성장의 신속하…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 NIH (R01NS064288)와 크레이그 H. Neilsen 재단 FZ의 보조금에 의해 지원되었다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
MEM Invitrogen 11090-081
Poly-D-Lysine hydrobromide Sigma -Aldrich P6407
Laminin Invitrogen 23017-015
5-fluoro-2-deoxyuridine Sigma -Aldrich F0503
Uridine Sigma -Aldrich U3003
Collagenase A Roche 10103578001
TrypLE Express Invitrogen 12604-013
Fetal bovine serum Invitrogen 10270-098
Penicillin-streptomycin (100X) Invitrogen 15140-122
GlutaMAX-I (100X) Invitrogen 35050-038
Glass coverslips (#1) Electron Microscopy sciences 72196-12
24 well cell culture plate Becton Dickinson 35-3047
1X PBS Mediatech 21-040-CV
Sterile, distilled and deionized water Mediatech 25-055-CV
Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons Lonza VPG-1001
ON-TARGETplus siRNA against c-Jun Dharmacon L-043776
Anti–βIII tubulin antibody (Tuj-1) Covance MMS-435P
ProLong Gold Antifade mounting solution Invitrogen P36930

References

  1. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
  2. Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
  3. Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
  4. Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
  5. Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
  6. Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
  7. Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
  8. Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
  9. Saijilafu, E. M., Hur, F. Q., Zhou, Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
  10. Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
  11. Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
  12. Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).

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Cite This Article
Saijilafu, Zhou, F. Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons. J. Vis. Exp. (66), e4141, doi:10.3791/4141 (2012).

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