الهندسة البكتيريا تمسكا من إنشاء واحدة الاصطناعية Curli OPERON
Summary
يوصف تصميم ترميز OPERON الاصطناعية على حد سواء جهاز إفرازية ومونومرات الهيكلية من ألياف curli. الافراط في هذه اميلويدس والبوليمرات تمسكا يسمح مكسب للقياس الانضمام لل<em> E. القولونية</em> حاوية<sup> 1</sup>. وأوضح طرق سهلة لتصور وقياس الالتزام.
Abstract
الطريقة الموضحة هنا يتمثل في إعادة تصميم E. خصائص الالتزام القولونية عن طريق تجميع الحد الأدنى لعدد الجينات curli تحت سيطرة أحد المروجين قوية والمعادن overinducible، وتصور وقياس في الربح الناتج من الالتزام البكتيرية. هذا الأسلوب ينطبق مبادئ الهندسة المناسبة من التجريد وتوحيد البيولوجيا التركيبية، والنتائج في Biobrick BBa_K540000 (أفضل جهاز Biobrick جديدة وهندستها، iGEM 2011).
الخطوة الأولى تتمثل في تصميم OPERON الاصطناعية المخصصة لفيض الإنتاج curli ردا على المعادن، وبالتالي في زيادة قدرات الانضمام للسلالة النوع البري. تم تعديل curli OPERON الأصلي في السيليكون من أجل تحسين إشارات النسخي ومتعدية والهروب من "الطبيعي" تنظيم curli. هذا النهج سمح لاختبار نجاح مع فهمنا الحالي للإنتاج curli. Moreoveص، وتبسيط تنظيم curli عن طريق التحول المروج الذاتية المعقدة (أكثر من 10 المنظمين النسخي المحددة) إلى المروج المعادن التنظيم بسيطة يجعل الالتزام أسهل بكثير للسيطرة.
الخطوة الثانية تشمل التقييم النوعي والكمي لقدرات التزام تنفيذ طرق بسيطة. هذه الأساليب تنطبق على طائفة واسعة من البكتيريا الملتصقة بغض النظر عن الهياكل البيولوجية المشاركة في تشكيل بيوفيلم. اختبار في لوحات البوليسترين الالتزام 24 جيد يوفر التصور السريع الأولية للبيوفيلم البكتيريا بعد تلطيخ البنفسجي الكريستال. ويمكن شحذ هذا الاختبار النوعي من تحديد مقدار النسبة المئوية للانضمام. هذه طريقة بسيطة جدا ولكن أكثر دقة من تلطيخ فقط البنفسجي الكريستال كما هو موضح سابقا 1 مع التكرار على حد سواء جيدة والتكاثر. التصور من البكتيريا GFP-الموسومة على الشرائح الزجاجية من قبل مضان أو أسيوط الليزرالمجهر ocal يسمح لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة الاختبار 24 جيد من قبل الملاحظة المباشرة لهذه الظاهرة.
Introduction
الانضمام إلى الدعم غير الحيوية البكتيرية تلعب دورا رئيسيا في خلايا الوقود المعالجة البيولوجية، أو التحفيز الأحيائي الميكروبية. عمليات المعالجة البيولوجية استخدام قدرات الكائنات الحية الدقيقة لتحلل المواد العضوية، أو لتعديل توزيع المعادن (الشلل، التطاير) أو انتواع. ويلاحظ في هذه الأنشطة المفيدة النظم الإيكولوجية المائية والأرضية، ولكن أيضا في النظم الاصطناعية وضعت لمعالجة المياه الملوثة من النفايات الصناعية والمنزلية. كثافة ونوعية للنشاط الميكروبي تعتمد على العوامل الفيزيائية والكيميائية، ولكن أيضا على نمط الحياة من الكائنات الحية الدقيقة (التعويم الحر أو تضمينها داخل بيوفيلم). ويرتبط تشكيل بيوفيلم مع الأيض تعزيز المقاومة لمبيدات الحشرات عن طريق آليات متنوعة. ولذلك يجب تشجيع هذه الظاهرة في معظم عمليات المعالجة البيولوجية. وعلاوة على ذلك، تم خلايا الإشريكية القولونية الهندسية للسيطرة على تشكيل بيوفيلم تطبيقها بنجاح علىشل خلية كاملة على أجهزة استشعار biochips 2-3.
التكيف من الكائنات الحية الدقيقة لتركيزات عالية من المعادن عن طريق آليات متنوعة يحدث مثل الامتزاز على مكونات المصفوفة خارج الخلية، تفعيل مضخة هروب رأس المال أو شبكات محددة قادرة على تركيز المعادن في الخلية. تعزيز هذه الأنشطة البكتيرية عن طريق الهندسة الوراثية يسمح العلاج الفعال والرخيص من التلوث بالمعادن في نطاق المختبر، وخاصة في حالة المعادن السامة جدا في ضعف الكمية كما وصفها راغو وآخرون 2008 4. المعالجة البكتيرية يمثل في هذه الحالة وسيلة إنقاذ تنافسية والتكلفة مقارنة العمليات الكيميائية الكلاسيكية باستخدام راتنجات التبادل الأيوني. وصف الكتاب وE. هيكل القولونية المعدلة وراثيا لامتصاص القشور والاحتفاظ الاولى ضرب الترميز الجينات هروب رأس المال مضخة ركونا، وبعد ذلك تحول مع نسخة متعددة البلازميد الإفراط في الإنتاج مما يسمح لأحدنقل مع امتصاص تفضيلية للالكوبالت. هذه السلالة يظهر كبديل فعال لراتنجات التبادل الأيوني لعلاج النفايات السائلة المشعة، ولكن القضية الرئيسية التي لم تحسم بعد التعافي من البكتيريا الملوثة في نهاية عملية 4. وكان الهدف من عملنا لذا لهندسة سلالة مصمم خصيصا قادرة على التمسك الدعم غير الحيوية مثل الزجاج أو البلاستيك.
من بين مجموعة كاملة من adhesins وخمل تمسكا المحددة في الغرام البكتيريا، اخترنا لتصميم نظام يسمح curli الإنتاج. Curli هي الألياف اميلويد رقيقة (2-5 نانومتر قطر) وحصري جدا أن تبرز من E. كولاي والسالمونيلا وسطح مصفوفة غير البلورية وغير قابلة للذوبان 5-7. وتشارك أيضا في Curli استعمار السطوح غير الحيوية، وتطوير الأغشية الحيوية 8. عرضت مؤخرا لربط أيونات Curli الزئبق 9. ومن المعروف بالفعل اميلويدس لامتلاك عاليةلأيونات المعادن تقارب مثل النحاس 2 +، 2 + الزنك والحديد 3 + 10. قد هذه الخاصية زيادة تحسين إزالة التلوث من النفايات السائلة الملوثة المعادن. الكتلة إداراته مسؤولة عن إنتاج الألياف curli وتشكل اثنين من operons المحولة divergently (الشكل 1). و، csgB csgA والجينات csgC تشكل OPERON المعنى، وهما ترميز الوحدات الصغرى curli، وCsgA CsgB. CsgC يبدو أن يشاركوا في أي نشاط الأكسدة داخل منظومة نشوء حيوي curli وتؤثر على السلوك CsgG المسام 11. ومع ذلك، فإن عدم وجود csgC في معظم البكتيريا المنتجة للcurli يشير إلى أن البروتين المقابل يوفر فقط على مستوى secundary من السيطرة على نشوء حيوي curli. لتبسيط النظام، وقد اخترنا العمل مع الحد الأدنى لعدد الجينات.
وcsgDEFG operonencodes البروتينات الضرورية في تنظيم وسائل النقلمن CsgA وCsgB إلى سطح الخلية. CsgD هو المنشط النسخي من OPERON csgBAC ويلعب دورا رئيسيا في السيطرة على تشكيل بيوفيلم عن طريق التحكم في إنتاج مكونات وخمل curli بيوفيلم أخرى مثل السليلوز 12 و من خلال منع انتاج السوط 13. CsgE، وCsgF CsgG تشكل جهاز إفرازية curli محددة في الغشاء الخارجي من خلالها، ويفرز الوحيدات curli الرئيسية CsgA البروتين وبروتين قابل للذوبان. البلمرة من CsgA يعتمد في الجسم الحي على CsgB غشاء محدد البروتين nucleator (تم استعراضها في 14). وقد ثبت مسارات التنظيمية المعقدة التي تنطوي على العديد من أنظمة ثنائية المكون للسيطرة على التعبير الجيني curli 15-16. هذه الأنظمة المعقدة تسمح للبكتيريا لتشكيل الأغشية الحيوية سميكة عن طريق إنتاج curli استجابة لمنبهات البيئة، ولكن يصعب التحكم في التطبيقات الصناعية. لتسهيل انتعاش الحدآل محشوة البكتيريا أثناء العملية الصناعية، تثبيت البكتيرية إلى دعم قوي يحتاج في الواقع إلى أن يسيطر عليها المعلمة واضحة المعالم (ق). وترتبط خصائص ملتصقة بهم من curli إلى 17 اميلويد الطبيعة، ويمكن استخدامها لتحسين عمليات المعالجة البيولوجية، ولكن جهاز أبسط والسيطرة عليها بسهولة لابد من خلق.
وقد تم اختيار هذه الجينات بين 7 18، ومجموعة من 5 مطلوب على الاطلاق الجينات لتخليق curli (csgB ومونومرات csgA الألياف الترميز) والتصدير (csgE csgF وcsgG، ترميز معقدة إفراز curli) لبناء OPERON الاصطناعية. هربا من "الطبيعي" تنظيم curli، وOPERON الاصطناعية تضم هذه الجينات إداراته 5 تحت سيطرة المروج قوية والكوبالت overinducible-(الشكل 2) تم تصميم وتوليفها. التحليل خطوة بخطوة في المنطقة curli ترميز وتصميم الإجراء لSYN الوظيفيةويرد وصف thetic OPERON. وأوضح طريقتين لتصور وقياس الالتزام البكتيرية إلى البوليسترين والزجاج.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة
الخطوة الأكثر أهمية في هذا النهج البيولوجيا التركيبية هو تصميم الجينات. تصميم الجينات الاصطناعية يجب أن يكون دقيق لضمان إنتاج نظام فعال. وقد تم تجميع اثنين من الجينات ترميز أحادية الألياف والبروتينات ترميز الجينا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء آخرين في فريق ليون iGEM INSA-ENS (فيفيان Chansavang، دوموند ماتيلد، ألكسندر دوبري، Geffroy ميلاني، Gonthier كليمنس، Jaulin مارجو، هاج أوريلي، Goki لي، Poinsot توماس، بيريل روير برتراند، Soula جولي، مايكل Vonzy بيار إيف زوندل، سفيان Bouhmadi، Brette أوليفييه، Chambonnier جايل، ايزارد لورا، Kroiss Aurianne، فيليب لوجون، رودريغ أنياس، Rondelet ارنو، وسيلفي Reverchon ديجاردان فاليري)، الرعاة على دعمهم المالي (BIOMERIEUX، ASSYSTEM، EDF، مؤسسة INSA، ENS ليون وإدارة العلوم البيولوجية INSA ليون)، F. Wisniewski صبغ للقراءة نقدية لهذه المخطوطة والدكتور CC سزي هدية التوتر. B. مرساة يتلقى دكتوراه الزمالة من منطقة الرون ألب.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
