הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד
Summary
העיצוב של קידוד סינטטי אופרון גם מנגנון ההפרשה ומונומרים המבניים של סיבי curli מתואר. ייצור יתר של amyloids אלה ופולימרי חסיד מאפשר מדידת רווח של היצמדות של<em> א coli</em> מארז<sup> 1</sup>. דרכים קלות כדי לחזות ולכמת דבקות מוסברות.
Abstract
השיטה המתוארת כאן מורכבת בעיצוב מחדש של ה תכונות היצמדות coli על ידי הרכבת המספר המינימאלי של גני curli תחת השליטה של אמרגן חזק והמתכת overinducible, ובהדמית וכימות הרווח כתוצאה של דבקות בקטריאלי. שיטה זו חלה עקרונות הנדסיים מתאימים של הפשטה ותקינה של ביולוגיה סינטתית, ותוצאות בBBa_K540000 Biobrick (המכשיר הכי חדש Biobrick, הנדסה, iGEM 2011).
הצעד הראשון מורכב בעיצוב של אופרון הסינטטי מוקדש לייצור יתר curli בתגובה למתכת, ולכן בהגדלת יכולות ההיצמדות של הזן הפראי הסוג. המקורי curli אופרון שונה בסיליקון ועל מנת לייעל את אותות תעתיק וtranslational ולברוח רגולציה "הטבעית" של curli. גישה זו אפשרה לבדיקה בהצלחת ההבנה הנוכחית שלנו של ייצור curli. Moreover, לפשט את רגולצית curli ידי מעבר האמרגן המורכב אנדוגני (יותר מ 10 רגולטורי תעתיק מזוהה) לאמרגן פשוט מתכת מוסדרת גורם דבקות הרבה יותר קלה לשלוט.
השלב השני כולל הערכה איכותית וכמותית של יכולות דבקות על ידי יישום של שיטות פשוטות. שיטות אלו חלות על מגוון רחב של חיידקים חסידים ללא קשר למבנים ביולוגיים המעורבים בהיווצרות biofilm. מבחן דבקות בצלחות קלקר 24 גם מספק הדמיה ראשונית מהירה של biofilm החיידקים לאחר צביעה סגולה גביש. מבחן איכותי זה יכול להיות מחודד על ידי הכימות של אחוז הדבקות. שיטה כזאת היא מאוד פשוטה אך מדויקת יותר מכתים סגולה גביש רק כפי שתואר לעיל 1 עם שתי דירות ושחזור טובים. ויזואליזציה של חיידקי ה-GFP-tagged על שקופיות זכוכית על ידי קרינה או conf הליזרמיקרוסקופיה ocal מאפשרת לחזק את התוצאות שהתקבלו במבחן הצלחת 24 היטב על ידי תצפית ישירה של התופעה.
Introduction
היצמדות חיידקים לתמיכת אביוטי ממלא תפקיד מרכזי בתאי דלק bioremediation, biocatalysis או חיידקים. תהליכי bioremediation להשתמש ביכולות של מיקרואורגניזמים לבזות חומרים אורגניים, או כדי לשנות את חלוקת המתכת (קיבוע, volatilization) או התפצלות. פעילויות מועילות אלו שנצפו במערכות אקולוגיות ימיות ויבשתיות, אלא גם במערכות המלאכותיות שפותחו לטיפול במים מזוהמים בפסולת תעשייתית וביתית. העצמה והאיכות של פעילות החיידקים תלויים בגורמים הפיסיקליים כימיים, אלא גם על אורח החיים של מיקרואורגניזמים (חסר בסיס או מוטבע לתוך biofilm). היווצרות biofilm קשורה חילוף חומרי קידום התנגדות לביוצידים ידי מנגנונים מגוונים. תופעה זו לכן יש לעודד ברוב תהליכי bioremediation. יתר על כן, תאי coli Escherichia הנדסה לשלוט על היווצרות biofilm כבר מיושמים בהצלחהחיישנים לשתק כל התאים בbiochips 2-3.
הסתגלות של מיקרואורגניזמים לריכוז גבוה של מתכות מתרחשת באמצעות מנגנונים מגוונים כגון ספיחה למרכיבים תאיים מטריקס, הפעלת משאבת זרימה או לספקים מסוגלים להתרכז המתכת לתוך התא. גברת פעילות חיידקים אלה באמצעות הנדסה גנטית מאפשרת טיפול יעיל וזול של זיהום מתכות בקנה מידת המעבדה, במיוחד במקרה של מתכות רעילות ביותר בכמות חלשה כפי שתואר על ידי הראגו et al. 2008 4. תיקון חיידקים מייצג במקרה זה שיטת חיסכון תחרותית ועלות בהשוואה לתהליכים כימיים קלסיים באמצעות רפי חילוף יונים. החוקרים תארו א מארז coli מהונדס גנטי לספיגה ואצירה 1 קובלט יפרוץ את זרימת משאבת הקידוד הגנטי rcnA, ולאחר מכן על ידי שינוי עם עותק רב המאפשרים ייצור יתר של פלסמידטרנספורטר עם ספיגה מועדפת לקובלט. כזה מתח מופיע כחלופה יעילה לרפי חילוף יונים לטיפול בשפכים רדיואקטיביים, אך בעיה לא נפתרה מפתח היא ההתאוששות של חיידקים מזוהמים בסופו של התהליך 4. המטרה של העבודה שלנו הייתה אפוא מהנדסת זן מותאם אישית מעוצב תוכל להיצמד לתומך אביוטי כגון זכוכית או פלסטיק.
בין המערך השלם של adhesins ונמצא מולת חסיד זיהתה בחיידקי גראם, בחרו לעצב מערכת המאפשרת ייצור curli. Curli הם סיבי עמילואיד דקים (2-5 קוטר ננומטר) ומדדים המאוד שבולט מE. חיידק סלמונלה ופני שטח כמטריצת גבישים שאינם מסיסה ו5-7. Curli מעורב גם בקולוניזציה של משטחי אביוטי והפיתוח של biofilms 8. Curli הוצגו לאחרונה לאגד כספיים יונים 9. Amyloids ידוע אכן להחזיק גבוהזיקה ליוני מתכות כגון Cu 2 +, Zn 2 + ו 3 + 10 פה. מאפיין זה עשוי לשפר עוד יותר את הטיהור של שפכים מזוהמים מתכת. אשכול CSG אחראי לייצור של סיבי curli והוא מכונן בשתי operons divergently תעתיקים (איור 1). CsgB, גני csgC csgA ומהווים אופרון התחושה, קידוד שתי יחידות curli, CsgA וCsgB. CsgC נראה שמעורב בפעילות חיזור בתוך מערכת biogenesis curli ולהשפיע על התנהגות CsgG נקבובית 11. עם זאת, היעדר csgC ברוב המכריע של חיידקי curli לייצור מצביע על כך שהחלבון המקביל מספק רק רמת secundary שליטת biogenesis curli. כדי לפשט את המערכת, אנחנו כבר בחרנו לעבוד עם המספר המינימאלי של גנים.
CsgDEFG operonencodes חלבונים חיוניים בוויסות והתחבורהשל CsgA וCsgB על פני התא. CsgD הוא activator תעתיק של אופרון csgBAC וממלא תפקיד מרכזי בשליטה על היווצרות biofilm על ידי שליטה על הייצור של רכיבים ונמצא מולת curli biofilm אחרים כגון 12 תאיים ועל ידי דיכוי ייצור השוטון 13. CsgE, CsgF וCsgG מהווים מנגנון הפרשה curli ספציפי ב- הקרום החיצוני שדרכו החלבון העיקרי CsgA מקטע curli מופרש כחלבון מסיס. פילמור של CsgA תלוי in vivo על nucleator חלבון CsgB קרום הנכנס (שנסקר ב14). מסלולים רגולטוריים שונים הכוללים מספר מערכות שני מרכיבים הוכחו לשלוט ביטוי curli גן 15-16. תקנות מורכבות אלה מאפשרות לחיידקי טופס biofilms העבה באמצעות ייצור curli בתגובה לאותות סביבתיים, אך קשים לשלוט עבור יישומים תעשייתיים. כדי להקל על ההתאוששות נפגשהאל ממולא חיידקים בתהליך תעשייתי, קיבוע חיידקים לתמיכה מוצקה אכן צריך להיות מבוקר על ידי פרמטר מוגדר היטב (הים). המאפיינים החסידים של curli צמודים ל17 טבע עמילואיד ויכולים לשמש כדי לשפר את תהליכי bioremediation, אבל מכשיר פשוט ובקלות מבוקר יש ליצור.
בין 7 גנים 18 אלה, קבוצה של 5 גנים נדרשת לcurli סינתזה (csgB ומונומרים סיבי קידוד csgA) ויצוא (csgE csgF וcsgG, קידוד מורכב הפרשת curli) בהחלט נבחרו לבנות אופרון הסינטטי. כדי להימלט מהרגולציה "הטבעית" של curli, אופרון סינטטי הכולל 5 גני CSG אלה תחת השליטה של אמרגן חזק וoverinducible קובלט (איור 2) תוכנן ומסונתז. ניתוח שלב אחר השלב באזור curli הקידוד ועיצוב ההליך לsyn פונקציונליהאוהד אופרון מתואר. שתי שיטות כדי לחזות ולכמת היצמדות חיידקים לקלקר וזכוכית מוסברות.
Protocol
Representative Results
Discussion
שלבים קריטיים
השלב הקריטי ביותר בגישת הביולוגיה הסינטתית הזה הוא עיצוב הגן. עיצוב גן סינטטי יש להקפיד על מנת להבטיח ייצור מערכת יעילה. שני גנים המקודדים את מונומרים סיבים ושלושה גני מקודדי חלבונים מעורבים במערכת ההפרשה שלהם כבר ה?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברים אחרים בצוות INSA-ENS iGEM ליון (ויויאן Chansavang, מתילדה דומונד, אלכסנדר Duprey, מלאני ז'פרואה, קלמנס Gonthier, מרגו Jaulin, Aurélie Haag, קונג Goki, תומאס Poinsot, תרשיש Royer ברטרנד, ג'ולי Soula, מיכאל Vonzy הפיר איב זונדל, Soufiane Bouhmadi, אוליבייה Brette, גאל Chambonnier, לורה אייזךד, Aurianne Kroiss, פיליפ ג'ן, Agnès רודריג, ארנו Rondelet, סילבי Reverchon וואלרי Desjardin), הספונסרים שלנו לתמיכה הכספית שלהם (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-ליון והמחלקה לBiosciences INSA-ליון), פ Wisniewski-דיי לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה וSze CC ד"ר למתנת לחץ. ב 'שרוול עוגן מקבל תואר דוקטור מלגה מאזור Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
