Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon
Summary
Het ontwerp van een synthetische operon codeert voor zowel de secretoire inrichting en de structurele monomeren Curli vezels beschreven. Overproductie van deze amyloïden en hechtende polymeren kan een meetbare versterking van de hechting van de<em> E. coli</em> Chassis<sup> 1</sup>. Slimme manieren om snel te visualiseren en te kwantificeren naleving worden toegelicht.
Abstract
De hier beschreven methode bestaat in E. herontwerpen coli hechting eigenschappen door het monteren van de minimum aantal Curli genen onder de controle van een sterke en metaal overinducible promoter en het visualiseren en kwantificeren van de winsten van bacteriële hechting. Deze methode is van toepassing geschikte engineering principes van abstractie en standaardisatie van de synthetische biologie, en de resultaten in de BBa_K540000 BioBrick (Beste nieuwe BioBrick apparaat, ontworpen, iGEM 2011).
De eerste stap bestaat uit het ontwerp van de synthetische operon gewijd aan Curli overproductie in reactie op metaal en derhalve het vergroten van de hechting mogelijkheden van de wild type stam. De oorspronkelijke Curli operon werd gewijzigd in silico om transcriptionele en translationele signalen te optimaliseren en te ontsnappen aan de "natuurlijke" regulering van Curli. Deze aanpak mag testen met succes ons huidige begrip van Curli productie. Moreover, de vereenvoudiging van de regelgeving Curli door over te schakelen van de endogene complex promotor (meer dan 10 transcriptionele regulatoren geïdentificeerd) om een eenvoudige metaal-gereguleerde promotor maakt de naleving veel makkelijker te controleren.
De tweede stap bestaat uit kwalitatieve en kwantitatieve beoordeling van de naleving vaardigheden door de uitvoering van eenvoudige methoden. Deze methoden zijn van toepassing op een breed scala van het aanklevende bacteriën ongeacht biologische structuren die betrokken zijn bij biofilmvorming. Hechting test in 24-well platen polystyreen een snelle eerste visualisatie van de bacteriële biofilm na kristalviolet kleuring. Deze kwalitatieve test kan worden versterkt door de kwantificering van het percentage hechting. Een dergelijke werkwijze is zeer eenvoudig maar nauwkeuriger dan alleen kristalviolet kleuring zoals eerder beschreven met een zowel een goede herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid. Visualisatie van GFP-gelabelde bacteriën op glas dia's met behulp van fluorescentie of laser confokale microscopie maakt het mogelijk om het versterken van de resultaten verkregen met de 24-well plaat test door directe waarneming van het fenomeen.
Introduction
Bacteriële hechting aan abiotische ondersteuning speelt een belangrijke rol in bioremediatie, biokatalyse of microbiële brandstofcellen. Bioremediatie processen gebruiken de capaciteiten van microorganismen aan organische stoffen afgebroken, of de metaalverdeling (immobilisatie vervluchtiging) of vorming wijzigen. Deze gunstige activiteiten worden waargenomen in aquatische en terrestrische ecosystemen, maar ook in de kunstmatige systemen ontwikkeld om vervuild water van industrieel en huishoudelijk afval te behandelen. De intensiteit en de kwaliteit van de microbiële activiteit afhankelijk fysisch-chemische factoren, maar ook van de levensstijl van micro-organismen (vrij zwevende of ingebed in biofilm). De biofilmvorming is gekoppeld aan een metabolisme bevorderen weerstand tegen biociden door verschillende mechanismen. Dit fenomeen zal dan ook worden aangemoedigd in de meeste bioremediatie processen. Bovendien heeft techniek Escherichia coli cellen om de biofilmvorming regelen succes toegepast opimmobiliseren whole-cell sensoren op biochips 2-3.
Adaptatie van microorganismen aan hoge concentratie van metalen plaatsvindt via diverse mechanismen, zoals adsorptie aan extracellulaire matrixcomponenten, activering van efflux pomp of specifieke dragers het metalen concentreren in de cel. Stimuleren deze bacteriële activiteiten via genetische manipulatie maakt een efficiënte en goedkope behandeling van metalen verontreiniging op laboratoriumschaal, vooral in het geval van zeer toxische metalen in zwakke hoeveelheid beschreven door Raghu et al.. 2008 4. Bacteriële sanering is in dit geval een concurrerende en kostenbesparing methode ten opzichte van klassieke chemische processen met ionenwisselaarharsen. De auteurs beschrijven een E. coli chassis genetisch gemanipuleerde voor kobalt opname en retentie eerst door het uitschakelen van de efflux pomp coderende gen rcnA en door transformatie met een multi-kopie plasmide zodat overproductie van eentransporter met preferentiële opname van kobalt. dergelijke stam wordt als een efficiënt alternatief ionenuitwisselingsharsen te behandelen radioactief afvalwater, maar een belangrijk onopgelost probleem is het herstel van besmette bacteriën aan het einde van het proces 4. Het doel van ons werk was dan ook om ingenieur een op maat ontworpen stam staat om naar de abiotische dragers zoals glas of plastic.
Onder de hele set van adhesinen en aanhanger fimbriae die in Gram-bacteriën, kozen we ervoor om een systeem waarbij Curli productie te ontwerpen. Curli dun (2-5 nm diameter) en zeer aggregatieve amyloid vezels die uitsteken uit de E. coli en Salmonella oppervlak als niet-kristallijne en onoplosbare matrix 5-7. Curli zijn ook betrokken bij de kolonisatie van abiotische oppervlakken en de ontwikkeling van biofilms 8. Curli werd onlangs aangetoond binden kwikionen 9. Amyloïden zijn inderdaad bekend dat bezit zijn van hogeaffiniteit voor metalen ionen, zoals Cu 2 +, Zn2 + en Fe3 + 10. Deze eigenschap kan een verdere verbetering van de sanering van metalen vervuilde afvalwater. CSG cluster is verantwoordelijk voor de productie van Curli vezels en is samengesteld uit twee divergent getranscribeerd operons (figuur 1). De CSGB, csgA en csgC genen vormen de zin operon, coderen voor de twee Curli subeenheden, CsgA en CSGB. CsgC lijkt betrokken bij redox activiteit binnen het Curli biogenese systeem en beïnvloeden CsgG porie gedrag 11. De afwezigheid van csgC in de meeste Curli producerende bacteriën dat het desbetreffende eiwit alleen een secundair niveau van controle over de Curli biogenese biedt. Vereenvoudiging van het systeem, hebben we gekozen om te werken met een minimum aantal genen.
De csgDEFG operonencodes eiwitten essentieel in de regulering van en het transportvan CsgA en CSGB naar het celoppervlak. CsgD is een transcriptionele activator van het csgBAC operon en speelt een belangrijke rol bij de controle van biofilmvorming door het regelen van de productie van Curli fimbriae en biofilm componenten zoals cellulose en 12 remmen de productie 13 flagellum. CsgE, CsgF en CsgG vormen Curli specifieke secretoire inrichting in de buitenmembraan waardoor grote Curli subeenheideiwit CsgA wordt uitgescheiden als een oplosbaar eiwit. De polymerisatie van CsgA hangt in vivo op de membraangebonden eiwit CSGB kiemvormer (beoordeeld in 14). Complexe regulerende pathways die verschillende tweecomponentensystemen is aangetoond Curli genexpressie controleren 15-16. Deze complexe regelgeving de bacteriën te dikke biofilms via de Curli productie als reactie op omgevingsfactoren vormen, maar zijn moeilijk te controleren voor industriële toepassingen. Om het herstel van de status van marktgericht te vergemakkelijkenbacteriën al-gevuld in een industrieel proces, bacteriële bevestiging aan een vaste drager is inderdaad worden door goed gedefinieerde parameter (s). De hechtende eigenschappen van Curli verbonden met hun aard amyloid 17 en kan worden gebruikt om bioremediatie te verbeteren echter eenvoudiger en eenvoudig te bedienen inrichting moet worden gecreëerd.
Onder deze 7 genen 18, een set van 5 absoluut vereist genen voor Curli synthese (CSGB en csgA codeert voor fiber monomeren) en uitvoer (csgE csgF en csgG, codeert de Curli secretie complex) werden geselecteerd om de synthetische operon construeren. Om de "natuurlijke" regulering van Curli, een synthetisch operon bestaat uit deze 5 CSG genen onder de controle van een sterke en kobalt-overinducible promotor (figuur 2) is ontworpen en gesynthetiseerd ontsnappen. De stap-voor-stap analyse van de Curli-coderende regio en de ontwerpprocedure voor een functionele synsynthetische operon beschreven. Er zijn twee methoden om te visualiseren en te kwantificeren bacteriële naleving van polystyreen en glas worden toegelicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen
De meest kritische stap in deze synthetische biologie aanpak is het gen ontwerp. Synthetische gen model moet zorgvuldig in een doeltreffende productie. Twee genen die coderen voor de fiber monomeren en drie genen die coderen voor eiwitten die betrokken zijn bij de secretie systeem zijn voorzien van een sterk en metaal-induceerbare promoter een nieuwe functionele eenheid voor een nieuwe toepassing te maken: de bio-decontaminatie van nucleaire effluent. Zoals gepland en voorspel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de andere leden van de Lyon INSA-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Melanie Geffroy, Clemence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurelie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Beryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon en Valerie Desjardin), onze sponsors voor hun financiële steun (bioMerieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon en het ministerie van Biosciences INSA-Lyon), F. Wisniewski-Dye voor kritische lezing van dit manuscript en Dr CC Sze voor stam geschenk. B. stabilisatieparachutes ontvangt een Ph.D. beurs van Region Rhône-Alpes.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn–csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer’s A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C., Callow,, J., Smith, A. M. . Biological Adhesives. , (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. . Experiments in molecular genetics. , (1972).
