पृथक कंकाल की मांसपेशियों में सिकुड़ना fatigability, और alternans के पूर्व vivo आकलन

Summary

हम सीधे मांसपेशी बल, बाहुबल, सिकुड़ा कैनेटीक्स और एक में पृथक कंकाल की मांसपेशियों की fatigability को मापने के लिए एक विधि का वर्णन<em> इन विट्रो में</em> क्षेत्र उत्तेजना प्रणाली का उपयोग कर. Ca पर बहुमूल्य जानकारी^{2 +} से निपटने के गुण और मांसपेशी के सिकुड़ा मशीनरी अलग उत्तेजक प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है.

Abstract

यहाँ वर्णित पृथक कंकाल की मांसपेशियों का सिकुड़ना को मापने के लिए एक तरीका है. मांसपेशी बल, बाहुबल, सिकुड़ा कैनेटीक्स, fatigability, और थकान के बाद वसूली के रूप में इस तरह के मानकों के लिए उत्तेजना संकुचन युग्मन के विशिष्ट पहलुओं (ECC) excitability के रूप में ऐसी प्रक्रिया है, सिकुड़ा मशीनरी और Ca ^{2 +} से निपटने करने की क्षमता का आकलन करने के लिए प्राप्त किया जा सकता है. इस विधि तंत्रिका और रक्त की आपूर्ति को हटा और पृथक कंकाल की मांसपेशी पर ही केंद्रित है. हम नियमित रूप से इस विधि का उपयोग करने के लिए आनुवंशिक घटक है कि हालांकि modulating Ca ^{2 +} संकेत दे रास्ते कंकाल की मांसपेशी के सिकुड़ा संपत्ति को बदलने की पहचान कर सकते हैं. यहाँ, हम विभिन्न और अमीर जानकारी कि इन विट्रो मांसपेशी सिकुड़ना परख में उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता का एक उदाहरण के रूप में एक नव पहचान कंकाल की मांसपेशी phenotype, यानी, मैकेनिक alternans, का वर्णन. इस परख के एकल कक्ष assays, आनुवंशिक दृष्टिकोण और biochemi साथ संयोजनstry assays कंकाल की मांसपेशी में ECC के तंत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं.

Introduction

कंकाल की मांसपेशियों कंकाल की हड्डियों के लिए देते हैं और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के नियंत्रण के अधीन सिकुड़ा बलों उत्पन्न. उत्तेजना संकुचन युग्मन (ECC) एक यांत्रिक जवाबी कार्रवाई के लिए एक बिजली के प्रोत्साहन को बदलने की प्रक्रिया के लिए संदर्भित करता है. Ca ^{2 +} संकेतन कंकाल की मांसपेशी में सिकुड़ा समारोह का एक अनिवार्य घटक है. प्रभावी Ca ^{2 +} sarcoplasmic जालिका (एसआर) से जुटाना ECC के लिए मांसपेशी कोशिकाओं ^{1, 2} में एक महत्वपूर्ण घटक है, और intracellular ² Ca में परिवर्तन ⁺ संकेतन मांसपेशी ^3-5 रोगों की संख्या में इसी सिकुड़ा रोग आबाद है. मांसपेशी सिकुड़ना के समुचित मूल्यांकन आवश्यक है और ² सीए करने के लिए स्वतंत्र है ⁺ इमेजिंग और अन्य assays कंकाल की मांसपेशी समारोह में अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए, सिकुड़ा स्तर पर ही नहीं, लेकिन यह भी गतिज स्तर पर. सेना और गति भी की महत्वपूर्ण संपत्ति को सूचित करने के लिए प्राप्त किया जा सकता हैमांसपेशियों और विभिन्न शारीरिक और pathophysiological शर्तों के तहत शक्ति ECC प्रक्रिया की स्थिति.

अनुसंधान के इस उपजाऊ क्षेत्र में एक बहुत समृद्ध इतिहास है और मांसपेशियों में संकुचन के कई सिद्धांतों दो ⁶ सदियों से दिखाई दिया. आधुनिक मांसपेशी अनुसंधान शायद Leeuwenhoek द्वारा ⁶ मांसपेशी फाइबर में पार striations और myofibrils का सूक्ष्म अवलोकन के साथ 1674-1682 में शुरू होता है. लगभग एक सदी बाद, Luigi Galvani मनाया कि मेंढक मांसपेशियों अनुबंध सख्ती जब अपने तंत्रिका स्केलपेल के साथ एक दूर बिजली ^7-9 मशीन से एक चिंगारी निर्वहन के दौरान छुआ है. संकुचन भी पेशी के लिए एक धातु कंडक्टर के माध्यम से पैर तंत्रिका को जोड़ने से उत्पादन किया जा सकता है. जटिल बिजली संकेतन तंत्र के विवरण Galvani द्वारा की वकालत अंततः उनके प्रसिद्ध समीकरण ^{11 10,} कि इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की नींव बन गया Hodgkin, हक्सले और Katz द्वारा तैयार थे. Rin की उल्लेखनीय टिप्पणियोंप्रासंगिकता की कोशिकी Ca ^{2 +} मेंढक दिल और कंकाल की मांसपेशियों ^12-15 का सिकुड़ना पर प्रभाव पर Ca ² की मान्यता में पहली बड़ी मांसपेशी सिकुड़ना ^{16, 17} के एक महत्वपूर्ण नियामक ⁺ कदम के रूप में प्रतिनिधित्व करते हैं. 1980 से वर्तमान दिन मांसपेशी सिकुड़ना क्षेत्र में खोजों में से एक फट कारण मांसपेशी सिकुड़ना और murine कंकाल ¹⁸ मांसपेशियों में fatigability प्रोटोकॉल की शुरूआत करने के लिए महसूस किया गया. जोन्स और एडवर्ड्स ¹⁹ ECC मशीनरी में परिवर्तन और सिकुड़ा तंत्र के साथ नहीं जुड़े थे कि कम आवृत्ति आंतरायिक थकान (बल में कमी व्यायाम प्रेरित) का सुझाव पहले थे. और Kolkeck एट अल ^20, Kolbeck और नोसेक ^21, और ²² रीड देर से 1980 और 1990 के दशक के आरंभ में, कृंतक मॉडल से डायाफ्राम मांसपेशी का उपयोग कर रहे थे कंकाल की मांसपेशी सिकुड़ना पर theophyllines, cortiosterone, और मुक्त कण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, जबकि ब्रूक्स और Faulknएर दोहराया शक्ति और तेजी से और ²² चूहों से धीमी गति से मांसपेशियों में शक्ति मापन की माप पर पहली रिपोर्ट थे. इसके अलावा, Lannegren, Westerblad, मेम्ने, और Westerblad के सीधे intracellular Ca ² विनियमन ^{+ के} साथ पूर्व vivo सिकुड़ना लिंक पहले थे और मांसपेशी थकान ^{23, 24} में अम्लरक्तता की भूमिका पूछताछ शुरू.

हमारी प्रयोगशालाओं काफी बरकरार माउस मांसपेशी सिकुड़ना अध्ययन के एक संयोजन का उपयोग करके जल्दी 2000 modulatory और नियामक भूमिकाओं के साथ उपन्यास जीन की समझ की दिशा में मांसपेशी सिकुड़ना, fatigability, और उम्र बढ़ने में महत्वपूर्ण भूमिका के साथ मांसपेशी ECC के बाद से योगदान दिया है, intracellular Ca ^{2 +} की निगरानी में बरकरार है और चमड़ी मांसपेशी फाइबर और आणविक आनुवंशिक जोड़तोड़ ^{3-5, 25-29.}

यहाँ हम murine पृथक soleus और extensor digitorum longus मापने सिकुड़ना (ईडी के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल विस्तृतएल) मांसपेशियों, ज्यादातर धीमी गति से oxidative (प्रकार मैं और IIa मांसपेशी फाइबर) और विशिष्ट सिकुड़ा गुणों के साथ एक तेजी से glyocolytic ज्यादातर मांसपेशियों (प्रकार IIb और IIx मांसपेशी फाइबर) जो के अनुरूप इस प्रोटोकॉल में बरकरार मांसपेशी कण्डरा परिसरों अलग और एक ADI PowerLab Radnotti कक्ष या तो शुद्ध ऑक्सीजन या ऑक्सीजन का एक मिश्रण (95%) और सीओ ₂ (5%) के साथ आपूर्ति प्रणाली में नहाया करते थे. सिकुड़ा बलों एक घास उत्तेजक औधधि से बिजली stimulations द्वारा उत्पन्न किया गया और एक बल transducer है कि एक ADI PowerLab/400 प्रणाली के साथ एकीकृत किया गया, मैक्रो दिनचर्या का अनुकूलन, डेटा का अधिग्रहण, संग्रह, डिजिटलीकरण और भंडारण को नियंत्रित करने के लिए अनुमति का उपयोग कर पाया. इस सेटअप मांसपेशियों में बल, बाहुबल, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बल बनाम आवृत्ति संबंध, मांसपेशियों में थकान, मांसपेशियों की थकान, गति और मांसपेशियों में संकुचन के समग्र गतिज गुणों से वसूली उपाय कर सकते हैं. इसके अलावा, मांसपेशियों में संकुचन पर दवाओं के प्रभाव इन प्रयोगों के माध्यम से नजर रखी जा सकती है. </p>

इस पद्धति का लाभ कंकाल की मांसपेशी से दूर neuronal और संवहनी उपकरणों को हटाने में रखना, मांसपेशियों के करार के आंतरिक गुणों के प्रत्यक्ष मूल्यांकन की अनुमति. इसके अलावा, पूर्व vivo सिकुड़ना assays कोशिकी पृथक मांसपेशियों आसपास के परिवेश, जो विभिन्न आयन पारगमन चैनलों और ट्रांसपोर्टरों के औषधीय जोड़तोड़ क्रम में कंकाल की मांसपेशी समारोह के लिए उनके शारीरिक भूमिकाओं को परिभाषित के उपयोग में सक्षम बनाता है के हेरफेर की अनुमति.

यह पूर्व vivo प्रणाली हमें हाल ही में एक अलग व्यवहार कुछ उत्परिवर्ती मांसपेशी की तैयारी में alternan ⁺ गुण जो बदल intracellular Ca ² से जुड़े थे ⁴ से निपटने की खोज करने के लिए अनुमति दी गई है. Alternans थकाऊ प्रोफाइल की गिरावट के चरण के दौरान सिकुड़ा बल के अस्थिर फट एपिसोड के रूप में परिभाषित कर रहे हैं. इन घटनाओं के दौरान सिकुड़ा बलों क्षण भर के बल घ के अपने पिछले स्तर से ऊपर वृद्धिथकाऊ उत्तेजना uring, शायद क्योंकि या तो अधिक ² Ca ⁺ जारी किया जा रहा है या सिकुड़ा मशीनरी अधिक Ca ^{2 30 +} प्रति संवेदनशील बन गया है. हैं cyclopiazonic एसिड (सीपीए) और sarcoplasmic जालिका कैल्शियम (SERCA) ATPase, कैफीन, ryanodine चैनल (RyR) के एक agonist के एक प्रतिवर्ती अवरोधक के उपचार और stimulations थकाऊ दोहराया सभी यांत्रिक alternans ⁴ को प्रेरित कर सकते हैं, सुझाव है कि alternans सीधे से संबंधित हैं चुनाव आयोग युग्मन प्रक्रिया के मॉडुलन. विधि का प्रदर्शन करने के लिए प्रेरित करने के लिए और इन विट्रो सिकुड़ना सेटअप में मैकेनिक alternans रिकॉर्ड विविध प्रयोगात्मक पैरामीटर है कि इस प्रणाली या इसी तरह के लोगों के साथ प्राप्त किया जा सकता है और व्यक्तिगत अनुसंधान के हितों के आधार पर, दिखाने के लिए एक उदाहरण के रूप में कार्य करता है.

इस विधि ब्याज की मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए हो सकता है. इसी तरह के सेटअप भी दूसरे से अलग कंकाल muscle-tendon/ligament परिसरों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंरचनात्मक स्थानों, के रूप में एकल फाइबर और मांसपेशी स्ट्रिप्स के लिए.

Protocol

समाधान: रचना 2.5 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान: 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2.5 मिमी CACL 2, 2 मिमी 2 MgCl और 10 मिमी ग्लूकोज 0 मिमी Ca 2 + Tyrode समाधान: 140 मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, 10 मिमी HEPES, 2 मिमी 2 MgCl, 0.1 मिमी इथाइली…

Discussion

सिकुड़ा बल और fatigability मापन के कंकाल की मांसपेशी समारोह के समग्र मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण है. इस परख के प्रमुख उद्देश्य मांसपेशियों की ताकत में परिवर्तन और कुछ रोग शर्तों के तहत थकाऊ गुण sarcopenia और मांसपेश…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5