Ex Vivo оценке сократимости, утомляемость и аНегпапз в изолированных скелетных мышц

Summary

Мы описываем метод непосредственного измерения мышечной силы, мышечной силы, сократительная кинетики и утомляемость изолированных скелетных мышц в<em> В пробирке</em> Системы с помощью полей стимуляцию. Ценную информацию о Ca^{2 +} Обработке свойств и сократительную техники мышц можно получить, используя различные стимулирующие протоколов.

Abstract

Описанный здесь метод измерения сократимость изолированной скелетной мускулатуры. Такие параметры, как сила мышц, мышечная сила, сократительная кинетики, утомляемость, и восстановления после усталости может быть получена для оценки конкретных аспектов возбуждения сокращения связи (ECC) процессов, таких как возбудимость, сократительная техники и Ca ^{2 +} обработка способности. Этот метод удаляет нерв и кровоснабжение и делает акцент на изолированном скелетные мышцы. Мы регулярно использовать этот метод для выявления генетических компонентов, которые изменяют сократительные свойства скелетных мышц, хотя модуляции Ca ^{2 +} сигнальных путей. Здесь мы описываем вновь выявленных скелетных мышц фенотип, то есть, механик аНегпапз, как пример разнообразной и богатой информации, которая может быть получена с использованием в пробирке анализа сократимости мышц. Сочетание этого анализа с одной анализы клетки, генетический подходы и биохимическихСтрый анализов может предоставить важную информацию о механизмах ECC в скелетных мышцах.

Introduction

Скелетные мышцы прикрепляются к костям скелета и генерировать сократительной силы под контролем центральной нервной системы. Возбуждение-сжатия связи (ECC) относится к процессу преобразования электрических стимулов для механического ответа. Ca ^{2 +} сигнализация является важным компонентом сократительной функции скелетных мышц. Эффективное Ca ^{2 +} мобилизации из саркоплазматического ретикулума (СР) является важным компонентом для ECC в мышечных клетках ^{1, 2,} и изменения внутриклеточного Ca ^{2 +} сигнализация лежат в основе соответствующего сократительной дисфункции в ряде мышечных заболеваний ^3-5. Правильная оценка сократительной способности мышц является важным и бесплатный Ca ^{2 +} визуализации и другие анализы, чтобы получить представление функции скелетных мышц, а не только на сократительную уровне, но и на кинетическом уровне. Сила и скорость могут быть также получены сообщить важное свойствомышечной силы и состояние процесса ECC при различных физиологических и патофизиологических условиях.

Это плодородный области исследований имеет очень богатую историю и множество теорий мышечного сокращения появилось более двух тысячелетий ^6. Современные исследования мышц, вероятно, начинается в 1674-1682 с микроскопическим наблюдением крест-страт и миофибрилл в мышечных волокнах Левенгук ^6. Почти столетие спустя, Луиджи Гальвани заметил, что контракты мышцы лягушки активно, когда его нерв коснулся скальпелем во время искрового разряда из далекого электрических машин ^7-9. Сокращение может также быть произведено путем подключения ногу нерва к мышце через металлический проводник. Подробная информация о комплексе электрический механизм сигнализации выступают Гальвани в конечном итоге были сформулированы Ходжкина, Хаксли и Кац в своем знаменитом уравнении ^{10, 11,} который стал основой электрофизиологии. Замечательные наблюдения Rinгер о воздействии внеклеточного Ca ^{2 +} на сократимость сердца лягушки и скелетных мышцах ^12-15 представляют собой первый важный шаг в признании Ca ^{2 +} в качестве ключевого регулятора мышечной сократимости ^{16, 17.} С 1980-х годов до наших дней всплеск открытий в области сократимость мышц был реализован в связи с введением сократимости мышц и утомляемость протоколов в мышиных скелетных мышц ^18. Джонс и Эдвардс были первыми, чтобы предположить, что низкая частота прерывистого усталости (упражнение вызванных сокращением в силу) ¹⁹ были связаны с изменениями в механизме ECC, а не сократительного аппарата. В конце 1980-х и начале 1990-х годов, Kolkeck и др. ^20, Kolbeck и Nosek ^21, и Рид ²² были использованием мышцы диафрагмы от грызунов моделей для изучения влияния теофиллины, cortiosterone, и свободных радикалов на скелетные сократимости мышц, в то время как Брукс и Faulknэ были первыми сообщить о повторяющихся измерений силы и мощности в быстрых и медленных мышц у мышей ^22. Кроме того, Lannegren, Westerblad, Lamb, и Westerblad были первыми, чтобы напрямую связать бывшие сократимость естественных условиях с внутриклеточного Са ^{2 +} регулировании и начали подвергать сомнению роль ацидоз в мышечной усталости ^{23, 24.}

Наши лаборатории внесли значительный вклад с начала 2000-х годов к пониманию новых генов с модулирующим и нормативной роли на мышцы ECC с важнейшую роль в мышечной сократимости, утомляемость и старение, используя сочетание нетронутой исследований мышцы мыши сократимость, внутриклеточный Ca ^{2 +} мониторинг неповрежденной и кожей мышечных волокон и молекулярно-генетических манипуляций ^{3-5, 25-29.}

Здесь мы подробно экспериментальный протокол для измерения сократимость изолированного мышиного камбаловидной и разгибателей пальцев мышцы (EDL) мышц, которые соответствуют главным образом медленным окислительного (тип I и IIa волокон мышц) и по большей части быстро glyocolytic мышцы (тип IIb и волокон IIx мышцы) с различными сократительных свойств. В этом протоколе целой мышцы, сухожилия комплексы были выделены и купались в ADI PowerLab Radnotti камерная система поставляется либо с чистым кислородом или смесью кислорода (95%) и CO ₂ (5%). Сократительных сил, создаваемых электрическими раздражениями из травы стимулятора и обнаружить, используя датчик силы, которая была интегрирована с системой ADI PowerLab/400, позволяя настраивать макро-процедур контроля приобретения, сбора, оцифровки и хранения данных. Эта установка может измерять силу мышц, мышечной силы, а также силы от частоты отношения, мышечной усталости, восстановления мышечной усталости, скорость и общую кинетические свойства мышц. Кроме того, воздействие наркотиков на сокращение мышц можно контролировать с помощью этих экспериментов. </p>

Преимущества этого метода заключается в удалении нейронов и сосудистого компонентов от скелетных мышц, что позволяет прямой оценки внутренних свойств сокращающейся мышцы. Кроме того, экс анализы сократимость естественных условиях позволяют манипуляции с внеклеточной средой окружающих изолированной мышцы, что позволяет использовать фармакологические манипуляции различных ионных каналов проникновения и перевозчиков с целью определения их физиологической роли функции скелетных мышц.

Это бывшая система естественных условиях позволил нам недавно обнаружили различные поведения alternan в некоторых мутантов подготовки мышц, которые были связаны с измененными внутриклеточного Ca ^{2 +} обработка свойства ^4. АНегпапз определяется как колебания эпизодов взрыв сократительной силы во время снижения фазы утомительно анкету. Во время этих событий сократительной силы мгновенно увеличить выше прежнего уровня силы Dтором утомительно стимуляции, возможно потому, что либо более Ca ^{2 +} в настоящее время освобождены или сократительной техника стала более чувствительной к Ca ^{2 + 30.} Лечение циклопьязониковой кислоты (CPA), обратимые блокатор саркоплазматического-эндоплазматической сети кальция АТФазы (SERCA), кофеин, агонист рианодиновых каналов (RyR) и утомительно повторяющихся раздражений могут вызвать механическое аНегпапз ^4, предполагая, что аНегпапз которые непосредственно связаны с модуляции процесса связью ЕС. Демонстрация метод, чтобы побудить и записывать механиком в аНегпапз в настройках сократимость пробирке служит в качестве примера, чтобы показать самые разнообразные экспериментальные параметры, которые могут быть получены с этой системой или подобные, основанные на индивидуальных интересов исследования.

Этот метод может представлять интерес для исследователей, изучающих физиологию мышц. Похожие настройки также могут быть использованы для изолированных скелетных комплексов muscle-tendon/ligament от другиханатомических местах, а также для одиночных волокон и мышечных полосок.

Protocol

Решение составе: 2,5 мМ Ca 2 + Tyrode решение: 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 10 HEPES мм, 2,5 мм CaCl 2, 2 мМ MgCl 2 и 10 мМ глюкозы 0 мМ Ca 2 + Tyrode решение: 140 мм NaCl, 5 мМ KCl, 10 HEPES мм, 2 мм MgCl 2, 0,1 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA) и 10 мМ глюкозы Примеч…

Discussion

Измерение сократительной силы и утомляемость имеет важное значение для общей оценки функции скелетных мышц. Основной целью этого анализа является выявление изменений в мышечной силе и утомительно свойства при некоторых патологических состояниях, таких как саркопения и мышечной уст?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5