隔離された骨格筋の収縮、倦怠感や交互の ex vivo での評価

Summary

我々は、直接筋力、筋パワー、収縮動態との単離された骨格筋の疲労を測定する方法を説明します<em> in vitroで</em>電場刺激を用いたシステム。カルシウムについての貴重な情報^{2 +}ハンドリング性や筋肉の収縮機械が異なる刺激プロトコルを使用して取得できます。

Abstract

ここで説明するには、隔離された骨格筋の収縮を測定する方法である。そのような筋力、筋パワー、収縮動態、易疲労感、疲労後の回復などのパラメータは、そのような興奮性として興奮収縮連関の特定の側面（ECC）のプロセスは、収縮機構とCa ^{2 +}ハンドリング能力を評価するために得ることができます。この方法では、神経と血液供給を削除し、単離骨格筋自体に焦点を当てています。我々は日常的に変調のCa ^{2 +}シグナル伝達経路のに骨格筋の収縮特性を変更する遺伝的要素を識別するためにこのメソッドを使用します。ここでは、in vitroでの筋収縮性アッセイで使用して得ることができる様々な、豊かな情報の一例として新たに同定された骨格筋の表現型、 すなわち 、機械的交互脈を記載している。単一細胞アッセイ、遺伝的アプローチと生化学とこのアッセイの組み合わせstryアッセイは、骨格筋のECCのメカニズムに重要な洞察を提供することができます。

Introduction

骨格筋は、骨格の骨に付着し、中枢神経系の制御の下で収縮力を発生させる。興奮収縮連関（ECC）は機械的な応答に電気刺激に変換するプロセスを指します。 Ca ^{2 +}シグナル伝達は骨格筋における収縮機能の重要なコンポーネントです。効果的なのCa ^2は筋小胞体（SR）から⁺動員は重要な筋肉細胞^1、2、ECCのための成分と、細胞内Ca ^{2 +}シグナル伝達の変化は、筋疾患^3-5の番号に対応する収縮機能障害の根底にある。筋収縮性の適切な評価は、Ca ²に不可欠と無料でご利用いただけます⁺イメージングおよび他のアッセイは、収縮性のレベルではなく、運動レベルではないだけで、骨格筋の機能についての洞察を得るために。力と速度はまたの重要な特性を知らせるために得ることができる筋力と異なる生理学的および病態生理学的条件下でECC処理のステータス。

この研究分野は非常に肥沃な豊かな歴史と筋収縮の多くの理論は、二千⁶の上に現れました。近代的な筋肉の研究はおそらくレーウェンフック⁶による筋線維のクロス線条と筋原繊維の顕微鏡観察で1674年から1682年に始まる。その神経が遠い電気機械^7月9日から火花放電時にメスで触れたときの、ほぼ一世紀後、ルイジ·ガルバーニはカエルの筋肉の収縮を激しくすることを観察した。収縮はまた、金属導体を介して筋肉に脚の神経を接続することによって生成することができる。ガルバーニが提唱する複雑な電気シグナル伝達機構の詳細は、最終的には電気生理学の基礎となった彼らの有名な方程式^10,11にホジキン、HuxleyとKatzによって策定されました。凛の驚くべき観察カエルの心臓や骨格筋^12月15日の収縮に細胞外Ca ^{2 +}の影響についてドイツは筋収縮性^16、17の重要な調節因子としてのCa ^{2 +}の認識の最初の大きな一歩を表しています。 1980年代から現在に至るまで筋収縮フィールドで発見のバーストが原因で筋肉の収縮およびマウス骨格筋¹⁸で疲労プロトコルの導入を実現しました。ジョーンズとエドワーズは、低周波断続的疲労（力の運動誘発還元^）19は ECCの機械ではなく、収縮装置の変化は認められなかった。示唆する最初でした一方、1980年代後半と1990年代前半に、Kolkeck ら ^20、ベックとノセク^21、リード^22は 、骨格筋の収縮にテオフィリン、cortiosterone、およびフリーラジカルの影響を研究する齧歯類モデルから横隔膜筋を使用していたブルックスとFaulknerがマウス²²から高速と低速の筋肉の力が繰り返されると、パワー測定の測定結果を報告する最初でした。また、Lannegren、Westerblad、子羊、そしてWesterbladは直接細胞内Ca ^{2 +}調節にex vivoでの収縮をリンクした最初と筋肉疲労^23,24におけるアシドーシスの役割に疑問を始めました。

私たちの研究所では、大幅に細胞内Ca ^{2 +}の監視で、そのままマウスの筋収縮の研究の組み合わせを使用することによって2000年代初頭に新規遺伝子の理解に向けて調節し、筋肉の収縮、疲労、老化において重要な役割を持つ筋肉のECCに関する規制の役割を持つので、貢献してきました無傷の肌の筋線維と分子遺伝子操作^{3-5、25から29。}

ここでは、マウス孤立ヒラメ筋と長趾伸筋（EDの収縮を測定するための実験プロトコルを詳述L）が異なる収縮特性を主に遅い酸化（タイプIおよびIIa筋線維）と、主に高速glyocolytic筋（IIb型とIIxの筋線維）に対応して筋肉、。このプロトコルでは、無傷の筋腱複合体を単離し、純酸素または酸素（95％）と、CO _2（5％）の混合物のいずれかに付属して、ADI PowerLabのRadnottiチャンバーシステムでびっしょり。収縮力は、草の刺激からの電気刺激によって生成され、マクロのルーチンのカスタマイズは、データの取得、収集、デジタル化、およびストレージを制御することができ、アナログ·デバイセズPowerLab/400システムと統合された力変換器を用いて検出した。このセットアップでは、筋力、筋パワーだけでなく、力対周波数の関係、筋肉疲労、筋肉疲労、スピード、筋収縮の全体的な速度論的性質からの回復を測定することができます。また、筋収縮に対する薬物の効果は、これらの実験を通して監視することができます。 </p>

この方法の利点は、筋肉を収縮させるの固有の特性を直接評価できるように、骨格筋から離れて神経や血管成分を除去することにあった。また、ex vivoでの収縮性アッセイは、骨格筋の機能のための彼らの生理的役割を定義するために、様々なイオン透過チャネルやトランスポーターの薬理操作の使用を可能に孤立筋肉を取り囲む細胞外環境の操作を可能にする。

このex vivoのシステムは、私たちが最近変更された細胞内Ca ^{2 +}ハンドリング性⁴に結合されていた特定の変異体の筋肉の準備、の明確なalternan動作を発見することができました。交互脈は疲労プロファイルの衰退期の間に収縮力の変動バーストエピソードとして定義されています。これらのイベントの間に収縮力が瞬間的に力Dのその前のレベルを超えて増加多くのCa ^{2 +が}リリースされているまたは収縮機械がCa ^{2 +を30}に敏感になっているのどちらかが原因と考えられるため、辛い刺激をuring。その交互脈は直接に関係している示唆リアノジンチャネル（RyR）を繰り返し疲労刺激のアゴニストは、すべての機械的交互脈を誘発することができるシクロピアゾン酸（CPA）は、筋小-小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）の可逆的遮断薬、カフェインの治療^4、 ECの結合過程の変調。 in vitroでの収縮のセットアップでのメカニックの交代を誘導し、記録する方法のデモンストレーションは、個々の研究の関心に基づいて、このシステムまたは類似のものを得ることができた多様な実験パラメータを表示する例となっています。

この方法は、筋肉生理学を勉強し研究者に興味があるかもしれません。同様のセットアップは、他から隔離された骨格muscle-tendon/ligament複合体にも使用できます解剖学的部位と同様、単繊維や筋肉のストリップのため。

Protocol

溶液組成： 2.5mMのCa 2 +のタイロード溶液：140mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのHEPES、2.5 mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2、10mMグルコース 0 mMのCa 2 +のタイロード溶液：140mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのHEPES、2mMのMgCl 2、0.1mMのエチレングリコール四酢酸（EGTA）、10mMのグルコース注：入浴液は、上記の溶液を使用している場?…

Discussion

収縮力と疲労の測定は、骨格筋の機能を総合的に評価するために重要である。このアッセイの主要な目的は、サルコペニアや筋肉疲労などの特定の病理学的な条件の下での筋肉の力の変化と疲労特性を明らかにし、筋収縮に薬/試薬の効果をテストすることです。筋力が密接に細胞内Ca ^{2 +の}放出と関連しているので、細胞外Ca ^{2 +流入}とこれらの2つの間のクロストークは、我々?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5