Ex Vivo Vurdering av kontraktilitet, trettbarhet og Alternans i isolerte skjelettmuskulatur

Summary

Vi beskriver en metode for å direkte måle muskelkraft, muskelkraft, kontraktile kinetikk og trettbarhet av isolerte skjelettmuskulatur i en<em> In vitro</em> Systemet med feltet stimulering. Verdifull informasjon om Ca^{2 +} Håndteringsegenskaper og kontraktile maskineri av muskelen kan oppnås ved hjelp av forskjellige stimulerende protokoller.

Abstract

Beskrevet her er en metode for å måle kontraktilitet av isolerte musklene. Parametere som muskel styrke, muskel kraft, kontraktile kinetikk, trettbarhet, og restitusjon etter utmattelse kan fås til å vurdere konkrete aspekter ved eksitasjon-kontraksjon kopling (ECC) prosess som oppstemthet, kontraktile maskiner og Ca ^{2 +} håndtering evne. Denne metoden fjerner nerve og blod forsyning og fokuserer på den isolerte skjelettmuskulatur selv. Vi rutinemessig bruker denne metoden for å identifisere genetiske komponenter som endrer kontraktile eiendom skjelettmuskulatur om modulerende Ca ^{2 +} signalveier. Her beskriver vi en nylig identifisert skjelettmuskulatur fenotype, dvs. mekaniker alternans, som et eksempel på de forskjellige og rike informasjon som kan oppnås ved å bruke in vitro muskelen kontraktilitet analysen. Kombinasjonen av denne analysen med encellede analyser, genetiske metoder og biochemistry analyser kan gi viktig innsikt i mekanismene for ECC i muskel-skjelettlidelser.

Introduction

Skjelettmuskulatur feste til bein i skjelettet og generere kontraktile styrker under kontroll av det sentrale nervesystemet. Eksitasjon-kontraksjon kopling (ECC) refererer til prosessen med å konvertere en elektrisk stimulans til en mekanisk respons. Ca ^{2 +} signalering er en essensiell komponent av den kontraktile funksjon i skjelettmuskel. Effektiv Ca ^{2 +} mobilisering fra sarcoplasmic retikulum (SR) er en viktig komponent for ECC i muskelcellene ^{1, 2,} og endringer i intracellulær Ca ^{2 +} signalering ligger til grunn for tilsvarende kontraktile dysfunksjon i en rekke muskelsykdommer ^3-5. Riktig vurdering av muskel kontraktilitet er viktig og gratis til Ca ^{2 +} bildebehandling og andre analyser for å få innsikt i skjelettmuskulatur funksjon, ikke bare på den kontraktile nivå, men også på den kinetiske nivå. Kraft og hastighet kan også fås til å informere viktig egenskapmuskelkraft og status for ECC-prosessen under ulike fysiologiske og patofysiologiske forhold.

Dette fruktbar forskningsfeltet har en meget rik historie og mange teorier om muskelkontraksjon dukket opp over to årtusener ^6. Moderne muskel forskning begynner trolig i 1674-1682 med mikroskopiske observasjon av kryss-striations og myofibrils i muskelfibre av Leeuwenhoek ^6. Nesten et århundre senere, observerte Luigi Galvani at frosk muskel kontrakter kraftig når det nerve er berørt med skalpell under en gnist utslippet fra et fjernt elektrisk maskin ^7-9. Sammentrekning kunne også bli produsert ved å koble beinet nerve til muskel gjennom et metall dirigent. Detaljene i komplekse elektriske signaler mekanisme orde av Galvani ble til slutt formulert av Hodgkin, Huxley og Katz i sin berømte ligning ^{10, 11} som ble grunnlaget for elektrofysiologi. Den bemerkelsesverdige observasjoner av Ringer om virkningene av ekstracellulært Ca ^{2 +} på kontraktilitet av frosk hjertet og skjelettmuskulaturen ^12-15 representerer det første store skrittet i erkjennelsen av Ca ^{2 +} som en viktig regulator av muskel kontraktilitet ^{16, 17.} Fra 1980-tallet til i dag en serie av funn i muskel kontraktilitet feltet ble realisert på grunn av innføring av muskel kontraktilitet og trettbarhet protokoller i murine skjelettmuskulatur ^18. Jones og Edwards var de første til å foreslå at lav frekvens intermitterende tretthet (anstrengelsesutløst reduksjon i kraft) ¹⁹ var assosiert med endringer i ECC maskiner og ikke kontraktile apparat. På slutten av 1980-tallet og tidlig 1990-tallet, ble Kolkeck et al ^20, Kolbeck og Nosek ^21, og Reid ²² bruker blender muskel fra gnagere modeller for å studere effekter av teofylliner, cortiosterone, og frie radikaler på skjelettmuskulatur kontraktilitet, mens Brooks og Faulkneh var de første til å rapportere om målinger av gjentatt kraft og effektmålinger i raskt og slow-muskler fra mus ^22. I tillegg var Lannegren, Westerblad, Lamb, og Westerblad den første til å direkte koble ex vivo kontraktilitet med intracellulær Ca ^{2 +} regulering og begynte avhør rolle acidose i muskeltretthet ^{23, 24.}

Våre laboratorier har bidratt vesentlig siden tidlig 2000-tallet mot forståelse av nye gener med modulerende og regulatoriske roller på muskel ECC med kritiske roller i muskel kontraktilitet, trettbarhet, og aldring ved hjelp av en kombinasjon av intakte mus muskel kontraktilitet studier, intracellulær Ca ^{2 +} overvåking i intakt og skinned muskelfibre og molekylærgenetiske manipulasjoner ^{3-5, 25-29.}

Her har vi detaljert forsøksprotokollen for måling kontraktilitet av murine isolerte soleus og extensor digitorum longus (EDL) muskler, som svarer til et hovedsakelig langsomt oksidativt (type I og IIA muskelfibre) og en hovedsakelig raskt glyocolytic muskel (attraksjon IIb og IIx muskelfibre) med distinkte kontraktile egenskaper. I denne protokollen, ble intakte muskel-sene komplekser isolert og badet i en ADI PowerLab Radnotti kammer system levert med enten rent oksygen eller en blanding av oksygen (95%) og CO ₂ (5%). Kontraktile krefter ble generert av elektriske stimuleringer fra en Grass stimulator og oppdaget ved hjelp av en kraft svinger som ble integrert med en ADI PowerLab/400 system, slik at tilpasning av makro rutiner for å kontrollere oppkjøpet, innsamling, digitalisering og lagring av data. Dette oppsettet kan måle muskelkraft, muskelkraft, samt kraft vs frekvens forholdet, muskeltretthet, utvinning fra muskeltretthet, hastighet og samlede kinetiske egenskaper muskelkontraksjon. I tillegg kan effekten av medikamenter på muskelkontraksjon overvåkes ved disse eksperimentene. </p>

Fordelene med denne metoden lå i å fjerne neuronal og vaskulære komponenter unna skjelettmuskulatur, som tillater direkte vurdering av de iboende egenskapene til kontrahering muskel. I tillegg, ex vivo kontraktilitet assays tillate manipulering av ekstracellulære miljøet rundt de isolerte muskler, som muliggjør bruk av farmakologiske manipulasjoner av ulike ion permeasjon kanaler og transportører for å definere deres fysiologiske roller for skjelettmuskel funksjon.

Dette ex vivo systemet har tillatt oss å nylig oppdage en tydelig alternan atferd i visse mutant muskel preparater, som var knyttet til endret intracellulær Ca ^{2 +} håndtering egenskaper ^4. Alternans er definert som varierende burst episoder av kontraktile kraft i løpet av nedgangen fasen av slitsom profilen. I løpet av disse hendelsene kontraktile krefter øyeblikk øke over sitt tidligere nivå av makt during strabasiøs stimulering, kanskje fordi enten mer Ca ^{2 +} blir lansert eller den kontraktile maskiner har blitt mer følsomme for Ca ^{2 + 30.} Behandling av cyclopiazonic acid (CPA), en reversibel blokkering av sarkoplasmatisk-endoplasmatisk retikulum kalsium ATPase (SERCA), koffein, en agonist av ryanodine kanal (Ryr) og gjentatt slitsom stimuleringer kan alle indusere mekaniske alternans ^4, noe som tyder på at alternans er direkte relatert til modulering av EC koblingen prosessen. Demonstrasjon av metoden for å indusere og registrere mekaniker alternans i in vitro kontraktilitet oppsett fungerer som et eksempel for å vise den diversifiserte eksperimentelle parametre som kan oppnås med dette systemet eller lignende som, basert på individuelle forskningsinteresser.

Denne metoden kan være av interesse for forskere som studerer muskel fysiologi. Lignende oppsett kan også brukes for isolerte skjelett muscle-tendon/ligament komplekser fra andreanatomiske steder, så vel som for enkle fibre og muskel strimler.

Protocol

Løsning sammensetning: 2,5 mM Ca 2 + Tyrode løsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2,5 mM 2 CaCl, 2 mM MgCl 2 og 10 mM glukose 0 mM Ca 2 + Tyrode løsning: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, 0,1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre (EGTA) og 10 mM glukose Merk: bading løsningen bør være mettet med 100% O 2 hvis bruker ovennevnte løsning, men med 95% O <…

Discussion

Måling av kontraktile kraft og trettbarhet er viktig for den samlede vurderingen av skjelettmuskulatur funksjon. De viktigste formålet med denne analysen er å identifisere endringer i muskelkraft og utmattende egenskaper under visse patologiske tilstander, for eksempel sarkopeni og muskeltretthet og å teste virkningen av narkotika / reagenser på muskel kontraktilitet. Siden muskelkraft er nært beslektet med intracellulær Ca ^{2 +} release, ekstracellulære Ca ^{2 +} oppføring og crosstalk mellom …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
2-APB	Tocris	1224	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and TRP etc.
SKF96365	Sigma	SKF-96365	Blocker of a number of Ca2+ entry channels including SOC and receptor-mediated Ca2+ entry etc.
BTP-2	Millipore	203890-5MG	Relatively specific SOC blocker
CPA	Sigma	C1530	Reversible SERCA blocker
caffeine	Sigma	C0750	Fast action RyR agonist
Radnoti Four Unit Tissue Organ Bath System	Radnoti	159920
Combination Tissue Support/Stimulating Electrode	Radnoti	160151	Vertical Zig Zag Type with tissue support
Quad Bridge Amp	ADInstruments	FE224
PowerLab/400	ADInstruments		This product is no longer available. Choose other version of the data acquisition system.
Force Transducers (5 mg – 25 g)	ADInstruments	MLT0201/RAD
Chart v4.02	ADInstruments		LabChart 7.3 is the latest version of Chart software.
S8800 Dual Pulse Digital Stimulator	GRASS TECHNOLOGIES		This product is no longer available. S88X Dual Output Square Pulse Stimulator is a newer stimulator.
RF Transformer Isolation Unit	GRASS TECHNOLOGIES	Model SIU5