يتم عزل نواة القلب عن طريق الترسيب وكثافة immunolabeled مع الأجسام المضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) لتحديد وفرز النوى cardiomyocyte بواسطة التدفق الخلوي.
وقد تم تحديد نوى cardiomyocyte تحديا في المقاطع النسيجية حيث أن معظم استراتيجيات الاعتماد فقط على البروتينات علامة حشوية 1. أحداث نادرة في myocytes القلب مثل انتشار وموت الخلايا المبرمج يحتاج الى تحديد دقيق للنواة خلية عضلية قلبية على تحليل تجديد الخلوية في التوازن وفي الحالات المرضية 2. هنا، ونحن نقدم وسيلة لعزل نواة cardiomyocyte من الأنسجة بعد الوفاة بواسطة الترسيب كثافة والوسم المناعي مع أجسام مضادة ضد مادة محيط بالمريكز 1 (PCM-1) واللاحقة الفرز التدفق الخلوي. هذه الاستراتيجية تسمح للتحليل إنتاجية عالية والعزلة مع الاستفادة من العمل بشكل جيد على قدم المساواة في الأنسجة الطازجة والمجمدة المواد الأرشيفية. هذا يجعل من الممكن لدراسة المواد التي تم جمعها بالفعل في biobanks. هذه التقنية قابلة للتطبيق واختبارها في مجموعة واسعة من الأنواع ومناسبة للتطبيقات المصب متعددة مثل الكربون 14 التي يرجع تاريخها 3، خلية-CYCLE تحليل 4، تصور من نظائرها ثيميدين (على سبيل المثال BrdU وإيدو) 4، وتحليل transcriptome وجينية.
تحديد دقيق للنوى cardiomyocyte هو أمر حاسم لتحليل عمليات التجدد في عضلة القلب 2،3. تقوم أساسا التقنيات التقليدية لعزل العضلية من الأنسجة جديدة على الهضم الأنزيمي من البروتينات المصفوفة خارج الخلية، وتنقية لاحق من الخلايا الخلالي عن طريق الطرد المركزي بسرعة منخفضة. ل?…
The authors have nothing to disclose.
نود أن نعترف مارسيلو تورو للمساعدة مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة السويدية القلب والرئة مؤسسة، مفوضية الاتحاد الأوروبي "CardioCell" FP7، السويدية مجلس البحوث والتأمينات AFA ومؤسسة آنا ليند. وأيد OB بواسطة جمعية الألمانية للبحوث.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |