Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Summary

Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.

Abstract

Identificatie van cardiomyocyten kernen is een uitdaging in het weefsel secties als de meeste strategieën vertrouwen op cytoplasmatische marker-eiwitten ^1. Zeldzame gebeurtenissen in hartspiercellen zoals de proliferatie en apoptose vereisen een nauwkeurige identificatie van de cardiale myocyten kernen om celvernieuwing in de homeostase en in pathologische voorwaarden ² te analyseren. Hier bieden we een methode om cardiomyocyt kernen te isoleren van post mortem weefsel door de dichtheid sedimentatie en immunokleuring met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) en de daarop volgende flowcytometrie sorteren. Deze strategie zorgt voor een hoge doorvoer analyse en isolatie met het voordeel van het werken even goed op verse en bevroren weefsel archiefmateriaal. Dit maakt het mogelijk te onderzoeken materiaal reeds verzamelde biobanken. Deze techniek is en getest in een groot aantal soorten en geschikt voor diverse toepassingen later zoals koolstof-14 datering ³ cel-cykel analyse ^4, visualisatie van thymidine-analogen (bv. BrdU en IDU) ^4, transcriptoom en epigenetische analyse.

Protocol

1. Isolatie van de Cardiac Kernen Coat ultracentrifuge buizen (Beckman centrifugebuizen # 363664) met 10 ml van 1% BSA / PBS coating oplossing. Cap de buizen en laten roteren gedurende 30 min in een buis rotator. Verwijder de coatingoplossing en laat de centrifugebuis drogen (een buis per muizenhart is voor de analyse van de muis hart, afwisselend tot 5 muizen hart of 1 g hartweefsel van een andere soort (bijv. humane) kunnen worden verwerkt in een buis). Alle volgende stappen moeten worden uitgevoe…

Discussion

Nauwkeurige identificatie van cardiomyocyt kernen is van cruciaal belang voor de analyse van regeneratieve processen in het myocard ^2,3. Conventionele technieken voor cardiomyocyten van sel isoleren zijn hoofdzakelijk gebaseerd op enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix en de daaropvolgende zuivering van interstitiële cellen door centrifugeren lage snelheid. Verdere zuivering van levende cardiomyocyten van embryonale stamcellen (SER) kan worden uitgevoerd door immunokleuring met markers zoals Sirp…

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR