사후 조직에서 Cardiomyocyte 핵의 분리
Summary
심장 핵은 밀도 침강 통해 격리 및 유동세포계측법 의해 cardiomyocyte 핵 파악하고 정렬하는 pericentriolar 소재 1 (PCM-1)에 대한 항체로 immunolabeled있다.
Abstract
대부분의 전략에만 세포질 마커 단백질 1에 의존로 cardiomyocyte 핵의 식별은 조직 섹션에 도전했습니다. 이러한 증식과 apoptosis와 같은 심장 myocytes에서는 드문 행사 심장 myocyte 핵의 정확한 신원은 항상성 및 병리 학적 조건 2의 세포 갱신을 분석해야합니다. 여기서는 pericentriolar 자료 1 (PCM-1)와 후속 유동세포계측법 정렬에 대한 항체가있는 밀도의 침강 및 immunolabeling으로 해부 조직에서 cardiomyocyte 핵을 분리하는 방법을 제공합니다. 이 전략은 신선한 조직 및 냉동 보관 물질에 동일하게 작업의 장점과 높은 처리량 분석 및 절연을 허용합니다. 이렇게하면 이미 biobanks에서 수집한 자료를 공부할 수 있습니다. 이 기술 적용과 종의 광범위한 테스트와 같은 탄소-14 데이트 3 셀 – 사 등 여러 다운 스트림 애플 리케이션에 적합하다CLE 분석 4, thymidine의 analogues의 시각화 (예 : BrdU와 이두) 4, transcriptome 및 epigenetic 분석.
Protocol
1. 심장 핵의 분리 1퍼센트 BSA / PBS 코팅 용액의 10 ML과 코트 ultracentrifuge 튜브 (Beckman의 원심 분리기 튜브 # 363664). 튜브를 모자하고 그들 튜브 회전에서 30 분 동안 회전하자. 코팅 용액을 제거하고 원심 분리기 튜브 공기 건조 (마우스 심장 당 하나의 튜브가 다른 종류의 단일 마우스 하트, 번갈아 최대 5 마우스의 마음이나 심장 조직의 1g의 분석에 필요한하게 (예 : 인간) 처리할 수 있습?…
Discussion
cardiomyocyte 핵의 정확한 신원은 myocardium 2,3의 재생 과정의 분석을 위해 매우 중요합니다. 신선한 조직에서 cardiomyocytes를 분리하기위한 종래의 기술은 주로 세포외 기질 단백질의 소화 효소 및 저속 원심 분리에 의한 간질 세포에서 이후의 정화를 기준으로합니다. 배아 줄기 세포 (ESC)에서 생활 cardiomyocytes의 자세한 정화는 같은 SIRPA 9 또는 mitochondrial 염료 10 표면 마커와 immun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 유동세포계측법와 도움 마르셀 토로 인정 싶어요. 이 연구는 스웨덴어 심장과 폐 재단, 유럽위원회는 FP7 "CardioCell", 스웨덴어 연구 협의회, AFA 보험 및 ALF에 의해 지원되었다. OB는 도이치 Forschungsgemeinschaft에 의해 지원되었다.
Materials
| 1. Lysis Buffer |
| Name of the reagent |
| 0.32 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesium acetate |
| 2.0 mM EDTA |
| 0.5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2. Sucrose buffer |
| Name of the reagent |
| 2.1 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesium acetate |
| 1 mM DTT |
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
| Name of the reagent |
| 0.44 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1.5 mM spermine |
| Reagents and Equipment | Company |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
| DRAQ5 | Biostatus |
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
| Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
| Influx cytometer | Beckman Coulter |
| Tube Rotator | VWR |
References
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Cite This Article
Bergmann, O., Jovinge, S. Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue. J. Vis. Exp. (65), e4205, doi:10.3791/4205 (2012).