Сердечная ядра изолированы с помощью осаждения и плотность immunolabeled с антителами против pericentriolar материал 1 (PCM-1) определить и сортировать ядер кардиомиоцитов с помощью проточной цитометрии.
Идентификация ядер кардиомиоцитов была сложной в срезах тканей большинство стратегий полагаться только на цитоплазматических белков-маркеров 1. Редкие события в кардиомиоциты, таких как пролиферации и апоптозе требуют точной идентификации сердечных миоцитов ядер для анализа клеточного обновления в гомеостаза и при патологических состояниях 2. Здесь мы предлагаем метод, чтобы изолировать ядер кардиомиоцитов из тканей после смерти путем осаждения и плотность immunolabeling с антителами против pericentriolar материала 1 (PCM-1) и последующая сортировка проточной цитометрии. Эта стратегия обеспечивает высокую пропускную способность и анализ изоляцией с преимуществом работы одинаково хорошо на свежем ткани и замороженных архивных материалов. Это позволяет изучать материалы уже собраны в биобанках. Этот метод применим и испытан в широком диапазоне видов и пригодны для нескольких ниже приложений, таких как углерод-14 знакомства 3, клетка-суCLE анализа 4, визуализация тимидина аналогов (например, BrdU и ПИН) 4, транскриптом и эпигенетических анализа.
Точная идентификация ядер кардиомиоцитов имеет решающее значение для анализа регенеративных процессов в миокарде 2,3. Обычные методы, чтобы изолировать кардиомиоцитов из свежей ткани в основном на основе ферментативного переваривания белки внеклеточного матрикса и последующе?…
The authors have nothing to disclose.
Мы выражаем свою признательность Marcelo Торо за помощь с проточной цитометрии. Работа выполнена при поддержке шведского сердца и легких фонда, Комиссии ЕС FP7 "CardioCell" Шведский исследовательский совет, AFA страхования и ALF. Б. был поддержан Deutsche Forschungsgemeinschaft.
1. Lysis Buffer |
Name of the reagent |
0.32 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM CaCl2 |
5 mM magnesium acetate |
2.0 mM EDTA |
0.5 mM EGTA |
1 mM DTT |
2. Sucrose buffer |
Name of the reagent |
2.1 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
5 mM magnesium acetate |
1 mM DTT |
3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
Name of the reagent |
0.44 M sucrose |
10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
70 mM KCl |
10 mM MgCl2 |
1.5 mM spermine |
Reagents and Equipment | Company |
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
DRAQ5 | Biostatus |
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
Influx cytometer | Beckman Coulter |
Tube Rotator | VWR |