Cardiomyocyte नाभिक का पोस्टमार्टम ऊतक से अलगाव
Summary
कार्डिएक नाभिक घनत्व अवसादन के माध्यम से अलग कर रहे हैं और pericentriolar 1 सामग्री (PCM-1) की पहचान करने और प्रवाह cytometry से cardiomyocyte नाभिक तरह के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ immunolabeled.
Abstract
Cardiomyocyte नाभिक की पहचान ऊतक वर्गों में चुनौती रहा है के रूप में सबसे रणनीतियों cytoplasmic प्रोटीन मार्कर एक पर ही निर्भर हैं. प्रसार और apoptosis जैसे हृदय myocytes में दुर्लभ घटनाओं हृदय myocyte नाभिक का एक सटीक पहचान homeostasis में और रोग 2 परिस्थितियों में सेलुलर नवीकरण का विश्लेषण करने की आवश्यकता है. यहाँ, हम पोस्टमार्टम ऊतक से घनत्व और pericentriolar 1 सामग्री (PCM-1) और बाद में प्रवाह cytometry छँटाई के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ अवसादन immunolabeling द्वारा cardiomyocyte नाभिक अलग तरीका प्रदान करते हैं. इस रणनीति के एक उच्च throughput विश्लेषण और ताजा ऊतक और जमे हुए अभिलेखीय सामग्री पर समान रूप से अच्छी तरह से काम करने के लाभ के साथ अलगाव की अनुमति देता है. यह पहले से ही biobanks में एकत्र सामग्री का अध्ययन करने के लिए यह संभव बनाता है. इस तकनीक को लागू प्रजातियों में से एक विस्तृत रेंज में परीक्षण और कार्बन 14-3 डेटिंग, सेल cy जैसे कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त हैcle 4 विश्लेषण, thymidine analogues के दृश्य (जैसे BrdU और IDU) 4, transcriptome और epigenetic विश्लेषण.
Protocol
Discussion
Cardiomyocyte नाभिक के सटीक पहचान 2,3 मायोकार्डियम में पुनर्योजी प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है. परम्परागत तकनीकों ताजा ऊतक से cardiomyocytes को अलग करने के लिए मुख्य रूप से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मार्सेलो टोरो प्रवाह cytometry के साथ सहायता के लिए स्वीकार करना है. इस अध्ययन स्वीडिश दिल और फेफड़े फाउंडेशन, यूरोपीय संघ आयोग के FP7 "CardioCell", स्वीडिश अनुसंधान परिषद, वायु सेना अकादमी बीमा और ALF द्वारा समर्थित किया गया था. ओ ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| 1. Lysis Buffer |
| Name of the reagent |
| 0.32 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM CaCl2 |
| 5 mM magnesium acetate |
| 2.0 mM EDTA |
| 0.5 mM EGTA |
| 1 mM DTT |
| 2. Sucrose buffer |
| Name of the reagent |
| 2.1 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 8) |
| 5 mM magnesium acetate |
| 1 mM DTT |
| 3. Nuclei storage buffer (NSB plus) |
| Name of the reagent |
| 0.44 M sucrose |
| 10 mM Tris-HCl (pH = 7.2) |
| 70 mM KCl |
| 10 mM MgCl2 |
| 1.5 mM spermine |
| Reagents and Equipment | Company |
| Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415 | Abcam |
| Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374 | Atlas Antibodies |
| Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody | Life Technologies |
| DRAQ5 | Biostatus |
| cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm | BD Biosciences |
| Glass douncer (40 ml) and pestle “L” | VWR (Wheaton Industries Inc.) |
| T-25 Ultra-Turrax Homogenizer | IKA Germany |
| Dispersing tool S25 N-18 G | IKA Germany |
| Beckman Avanti Centrifuge | Beckman Coulter |
| Falcon Tubes 15 ml and 50 ml | VWR |
| Beckman Centrifuge Tubes #363664 | Beckman Coulter |
| JS13.1 free swinging rotor | Beckman Coulter |
| Influx cytometer | Beckman Coulter |
| Tube Rotator | VWR |
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