El aislamiento de núcleos de cardiomiocitos a partir de tejidos post-mortem

Summary

Núcleos están aislados cardíaca a través de la sedimentación y la densidad de immunolabeled con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) para identificar y clasificar los núcleos de cardiomiocitos mediante citometría de flujo.

Abstract

Identificación de los núcleos de cardiomiocitos ha sido un desafío en secciones de tejido, como la mayoría de las estrategias se basan sólo en proteínas marcadoras frente al citoplasma de ^1. Los eventos raros en los miocitos cardíacos, como la proliferación y la apoptosis requiere una identificación precisa de los núcleos de los miocitos cardíacos para analizar la renovación celular en la homeostasis y en condiciones patológicas ^2. En este caso, se proporciona un método para aislar núcleos de cardiomiocitos de post mortem del tejido por la sedimentación y la densidad de inmunomarcación con anticuerpos contra el material pericentriolar 1 (PCM-1) y la clasificación posterior de citometría de flujo. Esta estrategia permite un análisis de alto rendimiento y el aislamiento con la ventaja de trabajar igualmente bien en tejido fresco y material de archivo congelado. Esto hace posible el estudio de material ya reunido en biobancos. Esta técnica es aplicable y probado en una amplia gama de especies y adecuado para múltiples aplicaciones posteriores tales como el carbono-14 contactos ^3, célula-CYculo ⁴ de análisis, la visualización de los análogos de timidina (por ejemplo, BrdU y UDI) ^4, el análisis de transcriptoma y epigenéticos.

Protocol

1. El aislamiento de los Núcleos cardiaca Tubos Coat ultracentrífuga Beckman (Tubos de centrífuga # 363664) con 10 ml de solución de revestimiento 1% de BSA / PBS. Tape los tubos y dejar que gire durante 30 minutos en un rotor de tubo. Eliminar la solución de revestimiento y dejar que la centrífuga tubos de aire seco (un tubo por el corazón del ratón se requiere para el análisis de los corazones de ratón individuales, alternativamente hasta 5 corazones de ratón o 1 g de tejido cardíaco de una espe…

Discussion

La identificación precisa de los núcleos de cardiomiocitos es crucial para el análisis de los procesos regenerativos en el miocardio ^2,3. Las técnicas convencionales para aislar cardiomiocitos a partir de tejido fresco se basan principalmente en la digestión enzimática de proteínas de matriz extracelular y la posterior purificación de las células intersticiales por centrifugación a baja velocidad. La purificación adicional de cardiomiocitos vivos a partir de células madre embrionarias (CES) puede …

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR