Isolement des noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus

Summary

Noyaux cardiaque sont isolés par sédimentation de densité et immunomarquées avec des anticorps contre matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) d'identifier et de trier les noyaux des cardiomyocytes par cytométrie de flux.

Abstract

Identification des noyaux des cardiomyocytes a été difficile dans des coupes de tissus comme la plupart des stratégies de compter uniquement sur ​​les protéines marqueurs cytoplasmiques ^1. Les événements rares dans les myocytes cardiaques tels que la prolifération et l'apoptose nécessite une identification précise des noyaux des myocytes cardiaques pour analyser le renouvellement cellulaire dans l'homéostasie et dans des conditions pathologiques ^2. Ici, nous fournissons une méthode pour isoler les noyaux de cardiomyocytes post-mortem des tissus par la sédimentation de densité et immunomarquage avec des anticorps contre le matériel péricentriolaire 1 (PCM-1) et après le tri par cytométrie en flux. Cette stratégie permet une analyse à haut débit et l'isolement avec l'avantage de travailler aussi bien sur les tissus frais et congelés documents d'archives. Cela permet d'étudier des documents déjà recueillis dans des biobanques. Cette technique est applicable et testé dans un large éventail d'espèces et adapté à de multiples applications en aval tels que le carbone-14 datant ^3, cellule-cyarticle analyse ^4, la visualisation des analogues de la thymidine (BrdU par exemple et les UDI) ^4, l'analyse du transcriptome et épigénétiques.

Protocol

1. Isolement des noyaux cardiaque Tubes ultracentrifugeuse Coat (Tubes à centrifuger Beckman # 363664) avec 10 ml de solution de revêtement de 1% de BSA / PBS. Reboucher les tubes et les laisser tourner pendant 30 min dans un rotateur tube. Retirer la solution de revêtement et de laisser la centrifugeuse tubes d'air sec (un tube par cœur de la souris est nécessaire pour l'analyse des cœurs de souris, en alternance jusqu'à 5 cœurs de souris ou 1 g de tissu cardiaque d'une espèce diffé…

Discussion

L'identification précise des noyaux des cardiomyocytes est crucial pour l'analyse des processus de régénération dans le myocarde ^2,3. Les techniques conventionnelles pour isoler les cardiomyocytes des tissus frais sont principalement basées sur la digestion enzymatique des protéines de la matrice extracellulaire et la purification ultérieure à partir de cellules interstitielles par centrifugation à faible vitesse. Une purification supplémentaire des cardiomyocytes vivant à partir de cellule…

Materials

1. Lysis Buffer

Name of the reagent

0.32 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM CaCl2

5 mM magnesium acetate

2.0 mM EDTA

0.5 mM EGTA

1 mM DTT

2. Sucrose buffer

Name of the reagent

2.1 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 8)

5 mM magnesium acetate

1 mM DTT

3. Nuclei storage buffer (NSB plus)

Name of the reagent

0.44 M sucrose

10 mM Tris-HCl (pH = 7.2)

70 mM KCl

10 mM MgCl2

1.5 mM spermine

Reagents and Equipment	Company
Isotype rabbit IgG- ChIP Grade, #ab37415	Abcam
Rabbit anti-PCM-1 antibody, #HPA023374	Atlas Antibodies
Donkey sec. antibody, anti-rabbit Alexa 488 Fluor, #A-21206 or equivalent sec. fluorescent antibody	Life Technologies
DRAQ5	Biostatus
cell strainers 30 μm, 70 μm and 100 μm	BD Biosciences
Glass douncer (40 ml) and pestle “L”	VWR (Wheaton Industries Inc.)
T-25 Ultra-Turrax Homogenizer	IKA Germany
Dispersing tool S25 N-18 G	IKA Germany
Beckman Avanti Centrifuge	Beckman Coulter
Falcon Tubes 15 ml and 50 ml	VWR
Beckman Centrifuge Tubes #363664	Beckman Coulter
JS13.1 free swinging rotor	Beckman Coulter
Influx cytometer	Beckman Coulter
Tube Rotator	VWR