Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal
Summary
Hemos desarrollado un enfoque quirúrgico novedoso para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en el feto de ratón. La ruta de entrega es más eficiente en la orientación de los pulmones fetales de ratón que el comúnmente utilizado intraamniótica inyección. Este procedimiento hasta la fecha no se ha descrito en un modelo de ratón.
Abstract
Entrega Prenatal pulmonar de células, genes o agentes farmacológicos podrían ser la base de nuevas estrategias terapéuticas para una variedad de enfermedades genéticas y adquiridas. Aparte de las anomalías congénitas o heredadas con el requisito de que a largo plazo la expresión del gen entregado, varias organizaciones no heredadas afecciones perinatales, donde a corto plazo la expresión génica o la intervención farmacológica es suficiente para lograr efectos terapéuticos, son considerados como posibles indicaciones futuras de este tipo de enfoque. Enfermedades candidatas para la aplicación de la terapia a corto plazo prenatal podría ser la deficiencia neonatal transitoria de la proteína surfactante B causando neonatal 1,2 síndrome de dificultad respiratoria o lesiones hyperoxic del pulmón neonatal 3. Enfermedades candidatos para la corrección terapéutica permanente son la fibrosis quística (FQ) 4, 5 variantes genéticas de deficiencia de surfactante y α1-antitripsina 6.
<clase p = "jove_content"> En general, una ventaja importante de la terapia génica prenatal es la capacidad de iniciar una intervención terapéutica temprana en el desarrollo, en o incluso antes de que las manifestaciones clínicas en el paciente, evitando así daños irreparables a la persona. Además, los órganos fetales tienen una mayor tasa de proliferación celular en comparación con órganos de adultos, que podrían permitir un gen más eficiente o transferencia de células madre en el feto. Además, en la entrega de genes útero se realiza cuando el sistema inmune del individuo no es completamente maduro. Por lo tanto, el trasplante de células heterólogas o la suplementación de una proteína no funcional o ausente con una versión correcta no debería causar sensibilización inmune a la célula, el vector o producto transgénico, que ha sido recientemente demostrado ser el caso con las terapias celulares y genéticos 7 .En el presente estudio, se investigó el potencial para tratar directamente la tráquea fetal en un ratón modelo. Este procedimiento está en uso en modelos animales más grandes tales como conejos y ovejas 8, e incluso en un entorno clínico 9, pero hasta la fecha no se ha realizado antes en un modelo de ratón. Cuando se estudia el potencial de la terapia génica fetal de enfermedades genéticas tales como la fibrosis quística, el modelo de ratón es muy útil como una primera prueba de concepto a causa de la amplia disponibilidad de diferentes cepas de ratones transgénicos, la embriogénesis bien documentado y el desarrollo fetal, menos estrictos normas éticas, gestación corta y el tamaño de la camada de gran tamaño.
Diversas vías de acceso se han descrito para dirigir el pulmón fetal de roedores, incluyendo la inyección intra-amniótico 10-12, (guiada por ultrasonido) intrapulmonar 13,14 inyección y la administración intravenosa en los vasos del saco vitelino 15,16 o vena umbilical 17. Nuestro procedimiento quirúrgico novedoso permite a los investigadores para inyectar el agente de elección directamente en la tráquea fetal de ratón que permitepara una entrega más eficaz de las vías respiratorias que las técnicas existentes 18.
Protocol
Discussion
Los pasos críticos
- La cepa de ratón se optó por trabajar con ratones NMRI es porque tienen un abundante número de crías (tamaño medio de la camada 14,4 ± 1,8, datos propios), tolerar intervenciones bien y tienen buenas características maternas.
- Colocación del cordón de bolsa a través de la pared del útero y las membranas fetales es un paso fundamental, ya que sólo quieren exponer la cabeza del feto y no los hombros, de lo contrario es casi imposible reposición sin causar trauma. <l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MC y AVDP son becarios de doctorado apoyados por subvenciones del Instituto para el Fomento de la Innovación mediante la Ciencia y la Tecnología en Flandes (IWT-Vlaanderen). JT tiene una beca a tiempo parcial Investigación Clínica (KOOR) de UZ Leuven. DV es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención de KU Leuven, DBOF/10/062. MMDC es un compañero de doctorado con el apoyo de una subvención del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq) y Erasmus Mundus. La investigación fue financiada por IWT-Vlaanderen, por el DIMI CE subvención (LSHB-CT-2005 a 512,146) y por el In vivo Molecular Imaging Research grupo (Imir) de la KU Leuven. Nos gustaría agradecer el Core Vector UPenn fundada por James M. Wilson por su especie de regalo del embalaje AAV6.2 plásmido para la producción de vectores rAAV.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| NMRI mice | Janvier, Le Genest St Isle, France | ||
| Isoflurane | Isoba, Intervet / Schering-Plough Animal Health, Milton Keynes, UK | ||
| Prolene 6-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| Vicryl 5-0 | Ethicon, Groot Bijgaarden, Belgium | ||
| 50 μl Hamilton Glass Syringe, Model 1710.5 TLLX SYR | Hamilton, Reno, NV, USA | 5495-20 | |
| 30G sharp needle | Hamilton, Reno, NV, USA | 7762-03 | |
| 2% xylocaine | AstraZeneca, Zoetermeer, The Netherlands |
References
- Willson, D. F., Notter, R. H. The future of exogenous surfactant therapy. Respir. Care. 56, 1369-1388 (2011).
- Abdel-Latif, M. E., Osborn, D. A. Intratracheal Clara cell secretory protein (CCSP) administration in preterm infants with or at risk of respiratory distress syndrome. Cochrane Database Syst. Rev. CD008308, (2011).
- Thebaud, B. Vascular endothelial growth factor gene therapy increases survival, promotes lung angiogenesis, and prevents alveolar damage in hyperoxia-induced lung injury: evidence that angiogenesis participates in alveolarization. Circulation. 112, 2477-2486 (2005).
- Griesenbach, U., Alton, E. W. Gene transfer to the lung: lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 128-139 (2009).
- Aneja, M. K., Rudolph, C. Gene therapy of surfactant protein B deficiency. Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 432-438 (2006).
- Flotte, T. R., Mueller, C. Gene therapy for alpha-1 antitrypsin deficiency. Hum. Mol. Genet. 20, R87-R92 (2011).
- Roybal, J. L., Santore, M. T., Flake, A. W. Stem cell and genetic therapies for the fetus. Semin Fetal Neonatal Med. 15, 46-51 (2010).
- Peebles, D. Widespread and efficient marker gene expression in the airway epithelia of fetal sheep after minimally invasive tracheal application of recombinant adenovirus in utero. Gene Ther. 11, 70-708 (2004).
- Deprest, J., Gratacos, E., Nicolaides, K. H. Fetoscopic tracheal occlusion (FETO) for severe congenital diaphragmatic hernia: evolution of a technique and preliminary results. Ultrasound Obstet. Gynecol. 24, 121-126 (2004).
- Buckley, S. M. Intra-amniotic delivery of CFTR-expressing adenovirus does not reverse cystic fibrosis phenotype in inbred CFTR-knockout mice. Mol. Ther. 16, 819-824 (2008).
- Davies, L. A. Adenovirus-mediated in utero expression of CFTR does not improve survival of CFTR knockout mice. Mol. Ther. 16, 812-818 (2008).
- Mitchell, M., Jerebtsova, M., Batshaw, M. L., Newman, K., Ye, X. Long-term gene transfer to mouse fetuses with recombinant adenovirus and adeno-associated virus (AAV) vectors. Gene Ther. 7, 1986-1992 (2000).
- Henriques-Coelho, T. Targeted gene transfer to fetal rat lung interstitium by ultrasound-guided intrapulmonary injection. Mol. Ther. 15, 340-347 (2007).
- Toelen, J. Fetal gene transfer with lentiviral vectors: long-term in vivo follow-up evaluation in a rat model. Am J Obstet Gynecol. 196, e1-e6 (2007).
- Waddington, S. N. Long-term transgene expression by administration of a lentivirus-based vector to the fetal circulation of immuno-competent mice. Gene Ther. 10, 1234-1240 (2003).
- Waddington, S. N. Permanent phenotypic correction of hemophilia B in immunocompetent mice by prenatal gene therapy. Blood. 104, 2714-2721 (2004).
- Senoo, M. Adenovirus-mediated in utero gene transfer in mice and guinea pigs: tissue distribution of recombinant adenovirus determined by quantitative TaqMan-polymerase chain reaction assay. Mol. Genet. Metab. 69, 269-276 (2000).
- Carlon, M. Efficient gene transfer into the mouse lung by fetal intratracheal injection of rAAV2/6.2. Mol. Ther. 18, 2130-2138 (2010).
- Schmiedl, A. Lipopolysaccharide-induced injury is more pronounced in fetal transgenic ErbB4-deleted lungs. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol Physiol. 301, L490-L499 (2011).
- Buckley, S. M. Factors influencing adenovirus-mediated airway transduction in fetal mice. Mol. Ther. 12, 484-492 (2005).
