Un test de perméabilité du neuro-épithélium embryonnaire poisson zèbre
Summary
Nous décrivons une mesure animal vivant ensemble quantitative de la perméabilité du cerveau du poisson zèbre embryonnaire. La technique analyse la capacité à retenir le liquide céphalorachidien et les molécules de poids moléculaires différents dans la lumière du tube neural et quantifie leur mouvement hors des ventricules. Cette méthode est utile pour déterminer les différences de perméabilité épithéliale et la maturation au cours du développement et de la maladie.
Abstract
Le système ventriculaire du cerveau est conservée chez les vertébrés et est composé d'une série de cavités interconnectées appelées ventricules du cerveau, qui forment dès les premières étapes du développement du cerveau et sont maintenus tout au long de la vie de l'animal. Le système ventriculaire du cerveau est trouvé chez les vertébrés, et les ventricules se développer après la formation du tube neural, lorsque la lumière centrale se remplit de liquide céphalo-rachidien (LCR) 1,2. Le LCR est un liquide riche en protéine qui est essentielle pour le développement normal du cerveau et la fonction 3-6.
Chez le poisson zèbre, l'inflation ventricule cérébral commence à environ 18 h après la fécondation (HPF), après que le tube neural se ferme. Plusieurs processus sont associés à la formation ventricule cérébral, y compris la formation d'un neuro-épithélium, la formation des jonctions serrées qui régule la perméabilité et la production de CSF. Nous avons montré que la Na, K-ATPase est nécessaire pour l'inflation ventricule cérébral, affectant tous ces processuses 7,8, tandis que la claudine 5a est nécessaire pour la formation des jonctions serrées 9. De plus, nous avons montré que «détente» du neuro-épithélium embryonnaire, par l'intermédiaire de l'inhibition de la myosine, est lié à l'inflation ventricule cérébral.
Pour étudier la régulation de la perméabilité lors du gonflage du poisson zèbre ventricule cérébral, nous avons développé un test de rétention ventriculaire colorant. Cette méthode utilise l'injection ventricule cérébral chez l'embryon du poisson zèbre vivant, une technique développée précédemment dans notre laboratoire 10, à fluorescence étiqueter le liquide céphalo-rachidien. Les embryons sont ensuite imagée au fil du temps à mesure que le colorant fluorescent à travers les ventricules cérébraux et neuro-épithélium. La distance de la face de colorant s'éloigne de la base (non luminale) du côté neuroépithélium dans le temps est quantifiée et est une mesure de la perméabilité neuroépithéliale (figure 1). Nous observons que les colorants et les petits 70 kDa se déplacera à travers la neuro-épithélium et peut être detected en dehors du cerveau embryonnaire du poisson zèbre à 24 hpf (Figure 2).
Ce test de rétention colorant peut être utilisé pour analyser la perméabilité neuroépithéliale dans une variété de contextes génétiques différents, à des moments différents au cours du développement, et après perturbations de l'environnement. Il peut également être utile dans l'examen de l'accumulation pathologique de la CSF. Dans l'ensemble, cette technique permet aux chercheurs d'analyser le rôle et la régulation de la perméabilité au cours du développement et de la maladie.
Protocol
Discussion
Nous démontrons la capacité de quantifier la perméabilité du cerveau embryonnaire du poisson zèbre vivant tel que déterminé pour un produit de contraste injecté d'un poids moléculaire donné. Nous avons observé que le poisson-zèbre embryonnaire est neuroépithélium différentielle perméable aux colorants de différentes masses moléculaires indiquent que le colorant se déplace via la perméabilité paracellulaire. Cependant, nous ne pouvons pas exclure la possibilité d'une contribution à la perm?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Institut national pour la santé mentale, et la National Science Foundation. Un merci spécial aux membres de laboratoire Sive pour de nombreuses discussions utiles et des critiques constructives, et à Olivier Paugois pour l'élevage de poissons d'experts.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
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