Анализ на проницаемость данио рерио Эмбриональные нейроэпителия
Summary
Мы описываем живого целого животного количественного измерения проницаемости эмбрионального мозга рыбок данио. Техника анализируется способность сохранять спинномозговой жидкости и молекул различных молекулярных весов в нейронной просвет трубки и количественное их движение из желудочков. Этот метод полезен для определения различий в проницаемости эпителия и созревание в процессе развития и болезни.
Abstract
Система желудочков мозга сохраняется среди позвоночных и состоит из серии связанных между собой полостей желудочков мозга называются, которые образуют на самых ранних стадиях развития мозга и поддерживаются в течение всей жизни животного. Система желудочков мозга находится у позвоночных, и желудочков развиваться после формирования нейронных трубки, когда центральная полость заполняется спинномозговой жидкости (ликвора) 1,2. CSF является богатой белком жидкости, которая необходима для нормального развития и функционирования мозга 3-6.
У рыбок данио желудочков мозга инфляции начинается около 18 часов после оплодотворения (HPF), после нервной трубки закрыт. Несколько процессов, связанных с формированием желудочков мозга, в том числе формирование нейроэпителия, плотным строем узел, который регулирует проницаемость и CSF производства. Мы показали, что Na, K-АТФазы необходима для мозга инфляции желудочка, влияющих всех этих процессовES 7,8, в то время Claudin 5а необходимо для формирования жесткой развязке 9. Кроме того, мы показали, что «расслабление» эмбрионального нейроэпителия, через подавление миозина, связанного с мозгом инфляции желудочка.
Для исследования регуляции проницаемости во время рыбок данио инфляции желудочка мозга, мы разработали удержания желудочка красителя анализа. Этот метод использует инъекции желудочков мозга в живом эмбриона данио рерио, техника, разработанные ранее в нашей лаборатории 10, в флуоресцентно маркировать спинномозговой жидкости. Эмбрионы затем отображаемого течением времени, как флуоресцентный краситель проходит через желудочки мозга и нейроэпителия. Расстояние красителя перед отходит от базального (без просвета) стороне нейроэпителия с течением времени количественно и является мерой нейроэпителиальных проницаемости (рис. 1). Заметим, что красители 70 кДа и меньше будет двигаться через нейроэпителия и может быть detecteD вне эмбрионального мозга рыбок данио на 24 HPF (рис. 2).
Этот краситель анализа удержания может быть использована для анализа нейроэпителиальных проницаемости в различных генетический фон, в разное время в процессе разработки, и после возмущения окружающей среды. Он также может быть полезен в изучении патологического накопления CSF. В целом, этот метод позволяет исследователям проанализировать роль и регуляция проницаемости в процессе развития и болезни.
Protocol
Discussion
Мы продемонстрировать способность количественно проницаемости жизни эмбрионального мозга рыбок данио, как это определено для вводится краситель данного молекулярного веса. Наши наблюдения, что эмбриональные нейроэпителия рыбок данио дифференциально проницаемой для красок различн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была выполнена при поддержке Национального института психического здоровья и Национального научного фонда. Особая благодарность членам Sive лаборатории за многочисленные полезные обсуждения и конструктивной критики, и Оливье Paugois для экспертов хозяйства рыбы.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
