אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במהלך פיתוח ומחלה.
Abstract
מערכת חדרית המוח נשמרת בין חוליות והוא מורכב מסדרה של חללים המחוברים ביניהם בשם חדרים במוח, שיוצר בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות מוח ונשמרים לאורך חייו של בעל החיים. מערכת חדרית המוח נמצאת בבעלי חוליות, ואת החדרים להתפתח לאחר היווצרות צינור עצבית, כאשר החלל המרכזי מתמלא בנוזל שדרה (CSF) 1,2. CSF הוא נוזל עשיר בחלבון שהוא חיוני להתפתחות תקינה של מוח ותפקוד 3-6.
בדג הזברה, אינפלצית חלל המוח מתחילה בכ 18 הפרית הודעה לשעה (hpf), לאחר שהצינור העצבי סגור. תהליכים מרובים קשורים בהיווצרות חלל מוח, כולל היווצרות neuroepithelium, היווצרות צומת הדוקה המווסתת את החדירות וייצור CSF. אנחנו הראינו כי Na, K-ATPase נדרש לאינפלצית חלל המוח, משפיעים כל התהליך אלהes 7,8, ואילו 5a claudin הוא הכרחי להיווצרות צומת הדוקה 9. בנוסף, הראה כי "רגיעה" של neuroepithelium העוברי, באמצעות עיכוב של שרירן, קשור באינפלצית חלל מוח.
כדי לחקור את הרגולציה של חדירות במהלך אינפלצית חלל מוח דג זברה, שפתחנו assay שמירת צבע חדרית. שיטה זו משתמשת בהזרקת חלל מוח בעובר דג זברת חיה, טכניקה שפותחה בעבר במעבדה שלנו 10, fluorescently לתייג את הנוזל השדרתי. עוברים ואז הם צלמו לאורך זמן את מהלכי צבע הניאון דרך החדרים במוח וneuroepithelium. המרחק מול הצבע מתרחק מהצד הבסיסי (שאינו luminal) של neuroepithelium לאורך הזמן הוא לכמת והוא מדידת חדירות neuroepithelial (איור 1). אנו צופים שבצבעים 70 KDA וקטן יעברו דרך neuroepithelium ויכולים להיות detecteד מחוץ למוח העוברי דג הזברה ב 24 hpf (איור 2).
assay שמירת צבע זה יכול לשמש כדי לנתח חדירות neuroepithelial במגוון רחב של רקע גנטי שונה, בזמנים שונים במהלך פיתוח, ולאחר הפרעות סביבתיות. זה יכול להיות שימושי גם בבדיקה פתולוגית של הצטברות CSF. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לנתח את התפקיד והרגולציה של חדירות במהלך פיתוח ומחלה.
Protocol
1. הכנה לmicroinjection הכן את מחטי microinjection ידי משייכת צינורות נימים באמצעות חולץ מחט מכשירי סאטר. מחט עומס microinjection עם צבע זרחני (FITC-dextran). הר מחט על micromanipulator ומכשירי microinjec…
Discussion
אנחנו מדגימים את היכולת לכמת חדירות של המוח העוברי דג זברת החיים כפי שנקבע לצבע מוזרק של משקל מולקולרי נתון. התצפית שלנו שneuroepithelium דג הזברה העוברית הוא דיפרנציאלי חדיר לצבעים שונים של משקולות מולקולריות מצביעה שהצבע עובר דרך חדירות paracellular. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לחברי מעבדת סייב לדיונים רבים שימושיים וביקורת בונה, ולאוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.