Assay לחדירות של Neuroepithelium עוברי דג הזברה
Summary
אנו מתארים מדידת חיה כל חיה כמוני לחדירות של מוח דג הזברה העוברי. הטכניקה מנתחת את היכולת לשמור על נוזל השדרתי ומולקולות של משקולות מולקולריות שונות בתוך חלל הצינור העצבי, והוא מכמת את תנועתם מחוץ לחדרי לב. שיטה זו יעילה לקביעת הבדלים בחדירות וההתבגרות אפיתל במהלך פיתוח ומחלה.
Abstract
מערכת חדרית המוח נשמרת בין חוליות והוא מורכב מסדרה של חללים המחוברים ביניהם בשם חדרים במוח, שיוצר בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות מוח ונשמרים לאורך חייו של בעל החיים. מערכת חדרית המוח נמצאת בבעלי חוליות, ואת החדרים להתפתח לאחר היווצרות צינור עצבית, כאשר החלל המרכזי מתמלא בנוזל שדרה (CSF) 1,2. CSF הוא נוזל עשיר בחלבון שהוא חיוני להתפתחות תקינה של מוח ותפקוד 3-6.
בדג הזברה, אינפלצית חלל המוח מתחילה בכ 18 הפרית הודעה לשעה (hpf), לאחר שהצינור העצבי סגור. תהליכים מרובים קשורים בהיווצרות חלל מוח, כולל היווצרות neuroepithelium, היווצרות צומת הדוקה המווסתת את החדירות וייצור CSF. אנחנו הראינו כי Na, K-ATPase נדרש לאינפלצית חלל המוח, משפיעים כל התהליך אלהes 7,8, ואילו 5a claudin הוא הכרחי להיווצרות צומת הדוקה 9. בנוסף, הראה כי "רגיעה" של neuroepithelium העוברי, באמצעות עיכוב של שרירן, קשור באינפלצית חלל מוח.
כדי לחקור את הרגולציה של חדירות במהלך אינפלצית חלל מוח דג זברה, שפתחנו assay שמירת צבע חדרית. שיטה זו משתמשת בהזרקת חלל מוח בעובר דג זברת חיה, טכניקה שפותחה בעבר במעבדה שלנו 10, fluorescently לתייג את הנוזל השדרתי. עוברים ואז הם צלמו לאורך זמן את מהלכי צבע הניאון דרך החדרים במוח וneuroepithelium. המרחק מול הצבע מתרחק מהצד הבסיסי (שאינו luminal) של neuroepithelium לאורך הזמן הוא לכמת והוא מדידת חדירות neuroepithelial (איור 1). אנו צופים שבצבעים 70 KDA וקטן יעברו דרך neuroepithelium ויכולים להיות detecteד מחוץ למוח העוברי דג הזברה ב 24 hpf (איור 2).
assay שמירת צבע זה יכול לשמש כדי לנתח חדירות neuroepithelial במגוון רחב של רקע גנטי שונה, בזמנים שונים במהלך פיתוח, ולאחר הפרעות סביבתיות. זה יכול להיות שימושי גם בבדיקה פתולוגית של הצטברות CSF. באופן כללי, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לנתח את התפקיד והרגולציה של חדירות במהלך פיתוח ומחלה.
Protocol
Discussion
אנחנו מדגימים את היכולת לכמת חדירות של המוח העוברי דג זברת החיים כפי שנקבע לצבע מוזרק של משקל מולקולרי נתון. התצפית שלנו שneuroepithelium דג הזברה העוברית הוא דיפרנציאלי חדיר לצבעים שונים של משקולות מולקולריות מצביעה שהצבע עובר דרך חדירות paracellular. עם זאת, אנחנו לא יכולים לשל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש, והקרן הלאומית למדע. תודה מיוחדת לחברי מעבדת סייב לדיונים רבים שימושיים וביקורת בונה, ולאוליבייה Paugois לגידול בעלי דגי מומחה.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
