En Assay for permeabilitet av Sebrafisk Embryonic Neuroepithelium
Summary
Vi beskriver en levende hel dyr kvantitativ måling for permeabilitet i embryonale sebrafisk hjernen. Teknikken analyserer evnen til å beholde cerebrospinalvæsken og molekyler av forskjellige molekylvekter innenfor nevralrøret lumen og kvantifiserer deres bevegelse ut av ventriklene. Denne metoden er nyttig for å bestemme forskjeller i epithelial permeabilitet og modning under utvikling og sykdom.
Abstract
Hjernen ventrikulære systemet er konservert blant virveldyr og er sammensatt av en serie av sammenkoblede hulrom kalt hjernen ventriklene, som danner under de tidligste stadiene av utvikling av hjernen og vedlikeholdes gjennom dyrets liv. Hjernen ventrikulære systemet finnes i virveldyr og ventriklene utvikler etter nevralrøret formasjon, når det sentrale lumen fylles med cerebrospinalvæsken (CSF) 1,2. CSF er en proteinrik væske som er viktig for normal utvikling av hjernen og funksjon 3-6.
I sebrafisk, begynner hjernen ventrikkel inflasjon på ca 18 timer etter befruktning (HPF), etter at nevralrøret er lukket. Flere prosesser er forbundet med hjernen ventrikkel formasjonen, inkludert dannelsen av et neuroepithelium, stramt veikryss formasjon som regulerer permeabilitet og CSF produksjon. Vi viste at Na, er K-ATPase kreves for hjernen ventrikkel inflasjon, påvirker alle disse prosess7,8 es, mens claudin 5a er nødvendig for tett junction dannelse 9. I tillegg viste vi at "velvære" av embryonale neuroepithelium, via hemming av myosin, er assosiert med hjernen ventrikkel inflasjon.
For å undersøke regulering av permeabilitet under sebrafisk hjernen ventrikkel inflasjon, har vi utviklet en ventrikulær fargestoff oppbevaring analysen. Denne metoden bruker hjernen ventrikkel injeksjon i en levende sebrafisk embryo, en teknikk tidligere utviklet i vår lab 10, til fluorescently merke cerebrospinalvæsken. Embryoer blir deretter avbildet over tid som fluorescerende fargestoff beveger seg gjennom hjernen ventriklene og neuroepithelium. Avstanden fargestoff fronten beveger seg bort fra den basale (non-luminal) siden av neuroepithelium over tid er kvantifisert og er et mål på neuroepithelial permeabilitet (Figur 1). Vi observerer at fargestoffer 70 kDa og mindre vil bevege seg gjennom neuroepithelium og kan være detected utenfor embryonale sebrafisk hjernen ved 24 HPF (Figur 2).
Dette fargestoff retensjon Målingen kan brukes til å analysere neuroepithelial permeabilitet i en rekke forskjellige genetiske bakgrunner, til forskjellige tider i løpet av utviklingen, og etter miljømessige perturbasjoner. Det kan også være nyttig i å undersøke patologisk akkumulering av CSF. Totalt sett gir denne teknikken etterforskerne å analysere hvilken rolle og regulering av permeabilitet under utvikling og sykdom.
Protocol
Discussion
Vi demonstrerer evnen til å kvantifisere permeabilitet av den levende embryonale sebrafisk hjernen som bestemmes for en injisert fargestoff av en gitt molekylvekt. Vår observasjon at embryonale sebrafisk neuroepithelium er forskjellig gjennomtrengelig for fargestoffer av ulike molekylære vekter tyder på at fargestoffet beveger via paracellular permeabilitet. Men vi kan ikke utelukke muligheten for en transcellular bidrag til den observerte permeabilitet. Denne teknikken kan brukes til enhver annen rørformet struktu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institute for Mental Health og National Science Foundation. Spesiell takk til Sive lab medlemmer for mange nyttige diskusjoner og konstruktiv kritikk, og til Olivier Paugois for sakkyndig fisk reindrift.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue number |
| Dextran, Fluorescein, Anionic, Lysine Fixable | Invitrogen | D7136, D7137, D1822, D1820, D1845 |
| Tricaine powder | Sigma | A5040 |
| Capillary Tubes | FHC Inc. | 30-30-1 |
References
- Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count. Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation. Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).
- Salehi, Z., Mashayekhi, F. The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study. Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).
- Martin, C. Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid. Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).
- Lehtinen, M. K. The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells. Neuron. 69, 893-905 (2011).
- Gato, A. Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos. Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).
- Lowery, L. A., Sive, H. Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system. Bioessays. 31, 446-458 (2009).
- Lowery, L. A., Sive, H. Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products. Development. 132, 2057-2067 (2005).
- Zhang, J. Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).
- Gutzman, J. H., Sive, H. Zebrafish brain ventricle injection. J. Vis. Exp. , (2009).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research. Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).
