שינוי Chemoselective של משטחים ויראלי באמצעות כימיה לחץ Bioorthogonal
Summary
חלקיקים adenovirus מתוכננים להכיל אנלוגי טבעי חומצת אמינו azidohomoalanine או סוכר azido<em> O</em>-GlcNAz. קבוצה אזיד של כל אחד ligated chemoselectively דרך "לחץ" התגובות כימיה כאמצעי שינוי פני ויראלי.
Abstract
שינוי של חלקיקי נגיף קיבל כמות משמעותית של תשומת לב פוטנציאל אדיר שלו להשפיע על ריפוי גנטי, יישומים oncolytic ופיתוח החיסון. 1,2,3 גישות שוטפות למשקי שינוי משטחים ויראלי, שהם בעיקר גנטיקה מבוסס, לעיתים קרובות סובלים הנחתה התמרה של ייצור וירוס, infectivity ו הסלולר. 4,5 באמצעות כימיה לחץ chemoselective, פיתחנו גישה חלופית פשוטה אשר עוקפת בעיות אלה תוך שמירה הן גמישות מאוד נגיש. 1,2
מטרת פרוטוקול זה היא להדגים את היעילות של שימוש כימיה לחץ bioorthogonal לשנות את פני השטח של סוג adenovirus 5 חלקיקים. תהליך זה שני שלבים ניתן להשתמש גם טיפולית 1 או אנליטי, 2,6 כפי שהוא מאפשר קשירת chemoselective של מולקולות, צבעים מיקוד או מולקולות אחרות של עניין על חלבוניםמראש תווית עם תגי אזיד. שלושת היתרונות העיקריים של השיטה הם (1) תיוג מטבולית מדגים מעט השפעה על כושר ויראלי, 1,7 (2) מגוון רחב של ligands מפעיל יכול להיות מנוצל, ו (3) הוא מהיר להפליא, אמינות קל לגשת. 1,2,7
בשלב הראשון של הליך זה, חלקיקים adenovirus מיוצרים הנושא או azidohomoalanine (אהה, פונדקאית מתיונין) או סוכר טבעי O-linked N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ושניהם מכילים אזיד (N-3) פונקציונלית הקבוצה. לאחר טיהור של אזיד-Modified חלקיקי נגיף, בדיקה alkyne המכיל מחצית ניאון טמרה הוא ligated באופן chemoselective על חלבונים או גליקופרוטאינים מראש שכותרתו. לבסוף, ניתוח SDS-PAGE מתבצע להפגין קשירת מוצלח של החללית על גבי חלבונים נגיפיים קפסיד. שילוב אהה מוצג לתייג כל capsid ויראליחלבונים (Hexon, פנטון ו Fiber), בזמן O-GlcNAz תוצאות לשילוב תיוג של סיבים בלבד.
בתחום זה מתפתחת, מספר שיטות קשירת אזיד-alkyne פותחו בהצלחה, אך רק 2 מצאנו להיות הנוחה ביותר הם הפגינו להלן – זן, לקדם אזיד-alkyne בחיי בן אשר (SPAAC) ונחושת-catalyzed אזיד-alkyne בחיי בן אשר (CuAAC) תחת אווירה deoxygenated.
Protocol
Discussion
התפתחות של תגובות לחץ chemoselective ו bioorthogonal, כולל אלה של azides, הוא אזור מתפתח במהירות, מחקר, ולאחר מכן יש מספר גדל והולך של התגובות הללו לבחירה עבור יישומים bioconjugation. הגבלנו את היקף פרוטוקול זה כך שיכלול רק שתי שיטות אשר נבחרו בשל התועלת שלהם במעבדה שלנו וזמינות מסחרית של חומ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות NSF למימון (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
References
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
- Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
- Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
- Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
- Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
- Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
- Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
- Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
- Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
- Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
