Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal
Summary
Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido<em> O</em>-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via "clique" reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.
Abstract
A modificação de partículas de vírus tenha recebido uma quantidade significativa de atenção para a sua enorme potencial para influenciar a terapia génica, as aplicações oncolíticos e desenvolvimento de vacinas. 1,2,3 As abordagens actuais para modificar superfícies virais, que são na sua maioria genética-based, geralmente sofrem de atenuação transdução de produção de vírus infeccioso, e celular. 4,5 Usando química clique quimiosselectiva, desenvolvemos uma abordagem alternativa simples que evita esses problemas, mantendo ao mesmo tempo altamente flexível e acessível. 1,2
O objectivo deste protocolo é demonstrar a eficácia da utilização de química do clique bioorthogonal para modificar a superfície do adenovírus tipo 5 partículas. Este processo de dois passos pode ser utilizado tanto terapeuticamente 1 ou analiticamente, 2,6, pois permite a ligadura quimiosselectiva de moléculas alvo, corantes ou outras moléculas de interesse para as proteínaspré-marcados com marcas de azida. As três principais vantagens deste método são que (1) marcação metabólica demonstra pouco ou nenhum impacto sobre a aptidão viral, 1,7 (2) uma vasta gama de ligandos efectoras podem ser utilizados, e (3) é extremamente rápido, fiável e de fácil acesso. 1,2,7
No primeiro passo deste procedimento, as partículas de adenovírus são produzidos tendo quer azidohomoalanine (Aha, um substituto de metionina) ou o açúcar não natural O-ligada N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos dos quais contêm a azida (-N 3) funcional grupo. Após a purificação das partículas de azida-vírus modificado, uma sonda contendo a porção alcino TAMRA fluorescente é ligada de uma maneira quimiosselectiva para as proteínas pré-marcados ou glicoproteínas. Finalmente, uma análise de SDS-PAGE é realizada para demonstrar a ligadura bem sucedida da sonda para as proteínas da cápside viral. Incorporação Aha é mostrado a rotular todos capsídeo viralproteínas (hexon, Penton e fibra), enquanto os resultados O-GlcNAz incorporação na rotulagem de fibra única.
Neste campo em evolução, vários métodos para azida-alcino ligadura foram desenvolvidos com sucesso, no entanto apenas os dois que temos encontrado para ser mais conveniente são demonstrados aqui – estirpe promovido cicloadição azida-alcino (SPAAC) e cobre-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC) sob atmosfera desoxigenado.
Protocol
Discussion
O desenvolvimento de reacções clique quimiosselectivas e bioorthogonal, incluindo os de azidas, é uma área em rápida evolução da investigação e, subsequentemente, há um número crescente de estas reacções a escolher para aplicações bioconjugação. Temos restringiu o âmbito deste protocolo para incluir apenas dois métodos, que foram escolhidos por causa de sua utilidade em nosso laboratório próprio e disponibilidade comercial de todos os reagentes.
Na primeira via, tais – e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de reconhecer a NSF para financiamento (CBET-0846259).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
References
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