Partículas de adenovírus são concebidos para conter tanto o azidohomoalanine análogo não natural amino ácido ou o açúcar azido O-GlcNAz. O grupo azida de cada um é quimiosselectivamente ligado via "clique" reações químicas, como forma de modificação da superfície viral.
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Artigo de método
Modificação de Superfícies quimiosseletiva virais através Química Clique Bioorthogonal
Neste artigo
Resumo
Resumo
A modificação de partículas de vírus tenha recebido uma quantidade significativa de atenção para a sua enorme potencial para influenciar a terapia génica, as aplicações oncolíticos e desenvolvimento de vacinas. 1,2,3 As abordagens actuais para modificar superfícies virais, que são na sua maioria genética-based, geralmente sofrem de atenuação transdução de produção de vírus infeccioso, e celular. 4,5 Usando química clique quimiosselectiva, desenvolvemos uma abordagem alternativa simples que evita esses problemas, mantendo ao mesmo tempo altamente flexível e acessível. 1,2
O objectivo deste protocolo é demonstrar a eficácia da utilização de química do clique bioorthogonal para modificar a superfície do adenovírus tipo 5 partículas. Este processo de dois passos pode ser utilizado tanto terapeuticamente 1 ou analiticamente, 2,6, pois permite a ligadura quimiosselectiva de moléculas alvo, corantes ou outras moléculas de interesse para as proteínaspré-marcados com marcas de azida. As três principais vantagens deste método são que (1) marcação metabólica demonstra pouco ou nenhum impacto sobre a aptidão viral, 1,7 (2) uma vasta gama de ligandos efectoras podem ser utilizados, e (3) é extremamente rápido, fiável e de fácil acesso. 1,2,7
No primeiro passo deste procedimento, as partículas de adenovírus são produzidos tendo quer azidohomoalanine (Aha, um substituto de metionina) ou o açúcar não natural O-ligada N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), ambos dos quais contêm a azida (-N 3) funcional grupo. Após a purificação das partículas de azida-vírus modificado, uma sonda contendo a porção alcino TAMRA fluorescente é ligada de uma maneira quimiosselectiva para as proteínas pré-marcados ou glicoproteínas. Finalmente, uma análise de SDS-PAGE é realizada para demonstrar a ligadura bem sucedida da sonda para as proteínas da cápside viral. Incorporação Aha é mostrado a rotular todos capsídeo viralproteínas (hexon, Penton e fibra), enquanto os resultados O-GlcNAz incorporação na rotulagem de fibra única.
Neste campo em evolução, vários métodos para azida-alcino ligadura foram desenvolvidos com sucesso, no entanto apenas os dois que temos encontrado para ser mais conveniente são demonstrados aqui - estirpe promovido cicloadição azida-alcino (SPAAC) e cobre-catalisada cicloadição azida-alcino (CuAAC) sob atmosfera desoxigenado.
Protocolo
Consulte a Tabela 1 para a preparação de todos os suportes, tampões e soluções referenciadas neste protocolo.
1. Produção de Aha-Rotulado Adenovírus
- Preparar onze 100-mm pratos de cultura de tecidos de células de rim embrionário humano (HEK 293) mantidas em meio de crescimento HEK 293 célula (ver Tabela 1) a 37 ° C até terem atingido os 80 - 90% de confluência. (Nota:. As culturas com mais de 90% de confluência pode ser difícil de infectar e podem não produzir vírus como desejado)
- Soltar as células em um dos pratos removendo primeiro o meio de crescimento, enxaguamento uma vez com 5 m....
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Discussão
O desenvolvimento de reacções clique quimiosselectivas e bioorthogonal, incluindo os de azidas, é uma área em rápida evolução da investigação e, subsequentemente, há um número crescente de estas reacções a escolher para aplicações bioconjugação. Temos restringiu o âmbito deste protocolo para incluir apenas dois métodos, que foram escolhidos por causa de sua utilidade em nosso laboratório próprio e disponibilidade comercial de todos os reagentes.
Na primeira via, tais - estirpe-promovido cicl.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Gostaríamos de reconhecer a NSF para financiamento (CBET-0846259).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
| Adenovírus tipo 5 (Ad5) contendo um transgene GFP | BCBC | 391 | |
| Rim de embrião humano (HEK 293) células | ATCC | CRL-1573 | |
| Dulbecco modificado por Eagle (DMEM), glucose elevada | Invitrogen | 11965-092 | |
| Modificação de Dulbecco Eagle Médium, não Metionina, não Cisteína (DMEM-Met /-Cys), glucose elevada | Invitrogen | 21013-024 | |
| Soro de vitelo | Invitrogen | 16170-078 | |
| Penicilina - estreptomicina 100 × Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 | |
| 0,5% de tripsina-EDTA (10 ×) | Invitrogen | 15400-054 | |
| 100 milímetros prato de cultura de células, cultura de tecidos de poliestireno tratada | BD Falcon | 353003 | |
| De cultura de células incubadora de CO 2 | |||
| Hemocitômetro | |||
| Biossegurança gabinete | |||
| Estéril filtro de seringa (0,2 um, acetato de celulose) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europa) | |
| Avanti centrífuga JE | Beckman Coulter | 369001 | |
| Tubos cónicos (50 ml, esterilizada) | BD Falcon | 352098 | |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13,2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 | |
| Ultracentrífuga equipado com um 41 SW e SW 60 rOTOR | Beckman | ||
| Eppendorf biopur Safe-Lock tubos, 1,5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 | |
| Centrífuga 5418 | Eppendorf | 5418 | |
| Centri-Sep rotação gel colunas de filtração | Separações Princeton | CS-901 | |
| Agulha estéril, calibre 18 | |||
| Saco de nitrogênio luva (se CuAAC desoxigenada deve ser realizado) | |||
| Frasco de Dewar | |||
| Nitrogênio líquido | |||
| Célula de eletroforese | |||
| Scanner de gel fluorescente | |||
| Pronto Gel de Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 | |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 | |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | ||
| Peracetilado N-azidoacetylgalactosamine (At 4 GalNAz) | Invitrogen | C33365 | |
| Thermo Scientific | 88905 | ||
| Sigma-Aldrich | A7480 | ||
| Batofenantrolina dissulfónico (BDA) sal dissódico | Biomedicals MP | 0215011201 | |
| Sulfóxido de dimetilo (DMSO) | |||
| Metanol | |||
| Base Tris (tris (hidroximetil) aminometano) | |||
| Fosfato dissódico (Na2 HPO 4) | |||
| Salina tamponada com fosfato (PBS) | |||
| HCl 1M | |||
| Glicerina | |||
| Albumina de Soro Bovino | |||
| L-cisteína | |||
| L-metionina | |||
| SDS (dodecilsulfato de sódio) | |||
| 2-mercaptoetanol | |||
| Glycine | |||
| Azul de bromofenol | |||
| De cloreto de césio (CsCl) | & Nbsp; | ||
| Brometo de cobre (I) (CuBr) | |||
| Cloreto de cálcio (CaCl2) | |||
| Cloreto de potássio (KCl) | |||
| Cloreto de magnésio (MgCl2) | |||
| Cloreto de sódio (NaCl) | |||
| Alcino sonda para * CuAAC | |||
| TAMRA alcino | Invitrogen | T10183 | |
| Sonda alcino tensa para * SPAAC | |||
| TAMRA DIBO alcino | Invitrogen | C10410 |
* Os vendedores notáveis de reagentes e kits de química clique incluem Invitrogen, Jena Biociências, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, clique em Ferramentas Química e Baseclick. Uma variedade de corantes alcino e ligandos de segmentação podem ser encontrados em catálogos estes fornecedores.
Referências
- Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
- Banerjee, P. S., Carrico, I. S.
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Reimpressões e permissões
