Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie
Summary
Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker enthalten<em> O</em>-GlcNAz. Die Azidgruppe eines jeden wird chemoselektiv über "Klick"-Chemie Reaktionen als mittels viraler Oberflächenmodifizierung ligiert.
Abstract
Die Modifikation von Viruspartikeln ist eine signifikante Menge an Aufmerksamkeit für die ein enormes Potenzial für ein Aufschlagen Gentherapie, onkolytischen Anwendungen und die Entwicklung von Impfstoffen erhalten. 1,2,3 Aktuelle Ansätze zur Modifizierung viralen Oberflächen, die meist Genetik-basiert sind, oft von der Dämpfung leiden Virus-Produktion, Infektiosität und zellulären Transduktion. Mit 4,5 chemoselektive Klick-Chemie, haben wir eine einfache alternative Methode, die diese Probleme umgeht, während verbleibenden hoch flexibel und zugänglich entwickelt. 1,2
Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Wirksamkeit der Verwendung bioorthogonalen Click-Chemie, die Oberfläche des Adenovirus Typ 5-Teilchen zu modifizieren demonstrieren. Dieses zweistufige Verfahren kann sowohl therapeutisch 1 oder analytisch 2,6 verwendet werden, wie es für die chemoselektive Ligation von Targeting-Moleküle, Farbstoffe oder andere Moleküle von Interesse erlaubt an Proteinemit Azid-Tags voretikettiert. Die drei wichtigsten Vorteile dieser Methode sind, dass (1) metabolische Markierung wenig bis gar keine Auswirkungen auf die virale Fitness, 1,7 demonstriert (2) eine breite Palette von Effektor-Liganden können verwendet werden, und (3) Es ist bemerkenswert schnelle, zuverlässige und einfach zu erreichen. 1,2,7
Im ersten Schritt dieses Verfahrens werden Adenoviruspartikel hergestellt trägt entweder azidohomoalanine (Aha, ein Methionin Surrogat-) oder die unnatürliche Zucker O-verknüpfte N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), die beide das Azid (N-3) funktionelle Gruppe. Nach der Reinigung der azidmodifizierten Viruspartikel, wird ein Alkin Sonde, die die fluoreszierende TAMRA-Einheit in einem chemoselektive Weise wie die Vor-markierte Proteine oder Glykoproteine ligiert. Schließlich wird eine SDS-PAGE-Analyse durchgeführt, um die erfolgreiche Ligation von der Sonde auf der viralen Capsidproteine zu demonstrieren. Aha Inkorporation wird gezeigt, dass alle Viruskapsids beschriftenProteine (Hexon, Penton und Fiber), während die O-Aufnahme resultiert in GlcNAz Kennzeichnung von Fiber nur.
In diesem sich entwickelnden Gebiet, haben mehrere Methoden für die Azid-Alkin-Ligation erfolgreich entwickelt, jedoch nur die beiden haben wir festgestellt, dass die bequemste haben werden hier gezeigt – Dehnungs-Azid-Alkin-Cycloaddition (SPAAC) und Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition (CuAAC) unter Sauerstoff befreiten Atmosphäre.
Protocol
Discussion
Die Entwicklung der chemoselektiven und bioorthogonale Click-Reaktionen, einschließlich derer von Aziden, ist eine sich schnell entwickelnde Gebiet der Forschung, und anschließend gibt es eine wachsende Zahl dieser Reaktionen aus für Biokonjugation Anwendungen wählen. Wir haben den Rahmen dieses Protokoll darauf beschränkt, nur zwei Methoden, die wegen ihrer Nützlichkeit in unserem eigenen Labor und kommerzielle Verfügbarkeit aller Reagenzien wurden so gewählt sind.
In der ersten sol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die NSF für die Finanzierung (CBET-0846259) anerkennen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene | BCBC | 391 |
| Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells | ATCC | CRL-1573 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose | Invitrogen | 11965-092 |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose | Invitrogen | 21013-024 |
| Bovine Calf Serum | Invitrogen | 16170-078 |
| Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) | Invitrogen | 15140-122 |
| 0.5% Trypsin-EDTA (10×) | Invitrogen | 15400-054 |
| 100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene | BD Falcon | 353003 |
| Cell culture CO2 incubator | ||
| Hemocytometer | ||
| Biosafety cabinet | ||
| Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) | VWR | 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe) |
| Avanti J-E centrifuge | Beckman Coulter | 369001 |
| Conical tubes (50 ml, sterile) | BD Falcon | 352098 |
| Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman | 344059 |
| Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor | Beckman | |
| Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml | Eppendorf | 0030 121.589 |
| Centrifuge 5418 | Eppendorf | 5418 |
| Centri-Sep gel filtration spin columns | Princeton Separations | CS-901 |
| Sterile needle, 18 gauge | ||
| Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed) | ||
| Dewar flask | ||
| Liquid nitrogen | ||
| Electrophoresis cell | ||
| Fluorescent gel scanner | ||
| Ready Gel Tris-HCl Gel | Bio-Rad | 161-1105 |
| L-Azidohomoalanine | AnaSpec | 63669 |
| Jena Biosciences | CLK-AA005 | |
| Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) | Invitrogen | C33365 |
| Thermo Scientific | 88905 | |
| Sigma-Aldrich | A7480 | |
| Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt | MP Biomedicals | 0215011201 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | ||
| Methanol | ||
| Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane) | ||
| Disodium Phosphate (Na2HPO4) | ||
| Phosphate buffered saline (PBS) | ||
| 1M HCl | ||
| Glycerol | ||
| Bovine Serum Albumin | ||
| L-cysteine | ||
| L-methionine | ||
| SDS (sodium dodecyl sulfate) | ||
| 2-mercaptoethanol | ||
| Glycine | ||
| Bromophenol blue | ||
| Cesium Chloride (CsCl) | ||
| Copper(I) Bromide (CuBr) | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | ||
| Potassium Chloride (KCl) | ||
| Magnesium Chloride (MgCl2) | ||
| Sodium Chloride (NaCl) | ||
| Alkyne probe for CuAAC* | ||
| TAMRA Alkyne | Invitrogen | T10183 |
| Strained alkyne probe for SPAAC* | ||
| TAMRA DIBO Alkyne | Invitrogen | C10410 |
* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.
References
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