Summary

Chemoselective Endring av Viral Overflater via Bioorthogonal Klikk kjemi

Published: August 19, 2012
doi:

Summary

Adenovirus partikler er konstruert for å inneholde enten unaturlig aminosyren analoge azidohomoalanine eller azido sukker<em> O</em>-GlcNAz. Den azide gruppe av hver er chemoselectively ligated via "klikk" kjemi reaksjoner som et middel for viral overflate modifikasjon.

Abstract

Modifikasjonen av viruspartikler har mottatt en betydelig mengde oppmerksomhet for sin enorme potensialet for å påvirke genterapi, oncolytic søknader og vaksineutvikling. 1,2,3 dagens tilnærminger til å endre viral overflater, som for det meste genetikk-baserte, ofte lider av demping virus produksjon, smittsomhet og cellulær transduksjon. 4,5 Bruke chemoselective klikk kjemi, har vi utviklet en grei alternativ tilnærming som sidesteps disse spørsmålene mens resterende både svært fleksibel og tilgjengelig. 1,2

Målet med denne protokollen er å demonstrere effekten av å bruke bioorthogonal klikk kjemi for å endre overflaten av adenovirus type 5 partikler. Denne to-trinns prosess kan brukes både terapeutisk 1 eller analytisk, 2,6 som det åpner for chemoselective ligation av målretting molekyler, fargestoffer eller andre molekyler av interesse på proteinerpre-merket med Azide tags. De tre store fordeler med denne metoden er at (1) metabolsk merking demonstrerer liten eller ingen innvirkning på viral fitness, 1,7 (2) et bredt spekter av effektor ligander kan utnyttes, og (3) det er bemerkelsesverdig rask, pålitelig og lett tilgang til. 1,2,7

I det første trinnet i denne fremgangsmåten, er adenovirus partikler produsert peiling enten azidohomoalanine (Aha, en metionin surrogat) eller unaturlig sukker O-forbundet N-azidoacetylglucosamine (O-GlcNAz), som begge inneholder natriumazid (-N 3) funksjonell gruppe. Etter rensing av azide-modifiserte viruspartikler, er en alkyne sonde som inneholder fluorescerende Tamra moiety ligated på en chemoselective måte til pre-merkede proteiner eller glykoproteiner. Til slutt, en SDS-PAGE-analyse utført for å demonstrere vellykkede ligation av sonden på de virale kapsid proteiner. Aha innlemmelse er vist å merke alle viral kapsidproteiner (Hexon, Penton og fiber), mens O-GlcNAz inkorporering resulterer i merking av Fiber bare.

I dette utvikler feltet, har flere metoder for azide-alkyne ligation blitt utviklet, men bare de to vi har funnet å være mest praktisk er demonstrert her – stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) og kobber-katalysert azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) under deoxygenated atmosfære.

Protocol

Se tabell 1 for utarbeidelse av alle medier, buffere og løsninger refereres til i denne protokollen. 1. Produksjon av Aha-merket Adenovirus Forbered elleve 100-mm vevskulturstudier retter av humane embryonale nyre celler (HEK 293) opprettholdes i HEK 293 cellevekst medium (se tabell 1) ved 37 ° C til de har nådd 80 – 90% confluency. (Merk:. Kulturer med confluency over 90% kan være vanskelig å infisere og kan ikke produsere virus som ønsket)…

Discussion

Utviklingen av chemoselective og bioorthogonal klikk reaksjoner, inkludert de av azider, er en hurtig utviklende område av forskning, og deretter er det et økende antall av disse reaksjonene å velge fra for bioconjugation applikasjoner. Vi har begrenset omfanget av denne protokollen til å omfatte bare to metoder som ble valgt på grunn av nytten sin i vår egen lab og kommersiell tilgjengelighet av alle reagenser.

I den første slike rute – stamme-forfremmet azide-alkyne cycloaddition (S…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi ønsker å anerkjenne NSF for finansiering (CBET-0846259).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
Adenovirus type 5 (Ad5) containing a GFP transgene BCBC 391
Human Embryonic Kidney (HEK 293) cells ATCC CRL-1573
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), High Glucose Invitrogen 11965-092
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no Methionine, no Cysteine (DMEM -Met / -Cys), High Glucose Invitrogen 21013-024
Bovine Calf Serum Invitrogen 16170-078
Penicillin – Streptomycin 100× Solution (Pen Strep) Invitrogen 15140-122
0.5% Trypsin-EDTA (10×) Invitrogen 15400-054
100 mm Cell Culture Dish, tissue-culture treated polystyrene BD Falcon 353003
Cell culture CO2 incubator    
Hemocytometer    
Biosafety cabinet    
Sterile syringe filter (0.2 μm, cellulose acetate) VWR 28145-477 (NA), 514-0061 (Europe)
Avanti J-E centrifuge Beckman Coulter 369001
Conical tubes (50 ml, sterile) BD Falcon 352098
Tube, Thinwall, Ultra-Clear, 13.2 ml, 14 x 89 mm Beckman 344059
Ultracentrifuge equipped with an SW 41 and SW 60 rotor Beckman  
Eppendorf Biopur Safe-Lock Tubes, 1.5 ml Eppendorf 0030 121.589
Centrifuge 5418 Eppendorf 5418
Centri-Sep gel filtration spin columns Princeton Separations CS-901
Sterile needle, 18 gauge    
Nitrogen glove bag (if deoxygenated CuAAC is to be performed)    
Dewar flask    
Liquid nitrogen    
Electrophoresis cell    
Fluorescent gel scanner    
Ready Gel Tris-HCl Gel Bio-Rad 161-1105
L-Azidohomoalanine AnaSpec 63669
Jena Biosciences CLK-AA005  
Peracetylated N-azidoacetylgalactosamine (Ac4GalNAz) Invitrogen C33365
Thermo Scientific 88905  
Sigma-Aldrich A7480  
Bathophenanthroline disulfonic acid (BDA) disodium salt MP Biomedicals 0215011201
Dimethyl sulfoxide (DMSO)    
Methanol    
Tris base (tris(hydroxymethyl)aminomethane)    
Disodium Phosphate (Na2HPO4)    
Phosphate buffered saline (PBS)    
1M HCl    
Glycerol    
Bovine Serum Albumin    
L-cysteine    
L-methionine    
SDS (sodium dodecyl sulfate)    
2-mercaptoethanol    
Glycine    
Bromophenol blue    
Cesium Chloride (CsCl)    
Copper(I) Bromide (CuBr)    
Calcium Chloride (CaCl2)    
Potassium Chloride (KCl)    
Magnesium Chloride (MgCl2)    
Sodium Chloride (NaCl)    
 
Alkyne probe for CuAAC*    
TAMRA Alkyne Invitrogen T10183
 
Strained alkyne probe for SPAAC*    
TAMRA DIBO Alkyne Invitrogen C10410

* Notable vendors of click chemistry reagents and kits include Invitrogen, Jena Biosciences, Berry Associates, Sigma-Aldrich, Glen Research, Click Chemistry Tools, and Baseclick. A variety of alkyne dyes and targeting ligands can be found in these vendors’ catalogs.

References

  1. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Chemoselective Attachment of Small Molecule Effector Functionality to Human Adenoviruses Facilitates Gene Delivery to Cancer Cells. J. Am. Chem. Soc. 132, 13615-13617 (2010).
  2. Banerjee, P. S., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Proteins Bearing Metabolically Introduced “Clickable” Amino Acids and Sugars. Methods Mol. Biol. 751, 55-66 (2011).
  3. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 8, 573-587 (2007).
  4. Magnusson, M. K., Hong, S. S., Henning, P., Boulanger, P., Lindholm, L. Genetic Retargeting of Adenovirus Vectors: Functionality of Targeting Ligands and Their Influence on Virus Viability. J. Gene Med. 4, 356-370 (2002).
  5. Henning, P., Lundgren, E., Carlsson, M., Frykholm, K., Johannisson, J., Magnusson, M. K., TÃ¥ng, E., Franqueville, L., Hong, S. S., Lindholm, L., Boulanger, P. Adenovirus Type 5 Fiber Knob Domain has a Critical Role in Fiber Protein Synthesis and Encapsidation. J. Gen. Virol. 87, 3151-3160 (2006).
  6. Zhang, M. M., Tsou, L. K., Charron, G., Raghavan, A. S., Hang, H. C. Tandem fluorescence imaging of dynamic S-acylation and protein turnover. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8627-8632 (2010).
  7. Banerjee, P. S., Ostapchuk, P., Hearing, P., Carrico, I. S. Unnatural amino acid incorporation onto adenoviral (Ad) coat proteins facilitates chemoselective modification and retargeting of Ad type 5 vectors. J. Virol. 85, 7546-7554 (2011).
  8. Hong, V., Presolski, S. I., Ma, C., Finn, M. G. Analysis and Optimization of Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition for Bioconjugation. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 9879-9883 (2009).
  9. Best, M. D. Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules. Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).
  10. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide-Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. J. Am. Chem. Soc. 46, 15046-15047 (2004).
  11. Dommerholt, J. Readily Accessible Bicyclononynes for Bioorthogonal Labeling and Three-Dimensional Imaging of Living Cells. Angew. Chem. Int. Ed. 49, 9422-9425 (2010).
  12. Link, A. J., Vink, M. K. S., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazotransfer. Nat. Protoc. 2, 1879-1883 (2007).
check_url/4246?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Rubino, F. A., Oum, Y. H., Rajaram, L., Chu, Y., Carrico, I. S. Chemoselective Modification of Viral Surfaces via Bioorthogonal Click Chemistry. J. Vis. Exp. (66), e4246, doi:10.3791/4246 (2012).

View Video