Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록
Summary
서브 마이크로 미터 공간과 하위 밀리 초 시간적 해상도 막 잠재적 인 변화의 모니터링을위한 이미징 기술은 설명되어 있습니다. 전압에 민감한 염색의 레이저 여기에 기반을 둔 기술은, axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 지점, 개인 수지상 쪽의 신호를 측정 할 수 있습니다.
Abstract
biophysical 속성과 하나의 뉴런의 기능 조직을 이해하고 어떻게 프로세스 정보가 뇌가 어떻게 작동하는지 이해하는 중요한 요소입니다. 모든 신경 세포의 주요 기능은 보통 여러 소스에서 전기 신호를 처리하는 것입니다. neuronal 프로세스의 전기적 특성은 세부 측정의 부재에 예측하기 매우 복잡한 동적, 그리고 일반 경우에는 불가능합니다. 하나가 겠어 이러한 측정을 얻으려면 이상적으로, 그들은 neuronal 프로세스 및 작업 가능성 개시에 영향을 특정 위치에서 summate에 원산지 사이트의 여행으로 여러 사이트에서 subthreshold 이벤트를 모니터링 할 수 싶어요. 이 목표는 전극을 채용 측정의 기술적 한계로 인해 모든 신경을 달성되지 않았습니다. 이 단점을 극복하기 위해, 그것은 광범위한 병렬 recordin을 허용 이미징 기술을 패치 – 전극 접근 방식을 보완하기 위해 매우 바람직하다신경 세포의 모든 부분에서 GS. 하위 밀리 초와 하위 마이크로 미터 해상도의 특징 – 유기 전압에 민감한 염료 (V m-영상)과 막 잠재적 인 과도의 광학 녹음 – 여기, 우리는 이러한 기술을 설명합니다. 우리의 방법은 전압에 민감한 분자 프로브 2 선구적인 작업을 기반으로합니다. 초기 기술의 여러 측면이 지속적으로 수십 년 3, 5, 11을 통해 향상되었습니다. 또한, 이전의 작품은 V m 이미징의 두 중요한 특성을 문서화. 첫째, 형광 신호는 전체 생리적 범위 (, 10, 14, 16 100 뮤직 비디오에 -100 뮤직 비디오)를 통해 막전위에 비례합니다. 둘째, 여기에 사용되는 전압에 민감한 염료 (JPW 3028)와로드 뉴런이 감지 약리 효과가 없습니다. 기록 염료를로드하는 동안 스파이크를 확대하는 것은 7 4 완전히 치료입니다. 또한, 실험 증거는 확보하는 것이 가능하다는 것을 보여줍니다모든 감지 phototoxic 효과 4 이전 녹음의 상당수 (최대 수백), 6, 12, 13. 현재, 우리는 V m-이미징 기술의 감도를 극대화 할에 가까운 최적의 파장 레이저 광원의 뛰어난 밝기와 안정성의 이점을 누리십시오. 현재 감도는 axons과 축삭의 민간인 피해, 터미널 수지상 가지, 개인 수지상의 쪽 포함하여 신경 세포의 모든 부분에서 V m의 과도의 여러 사이트 광학 녹음 할 수 있습니다. 신호의 상호 작용을 취득 정보뿐만 아니라 동영상의 형태로 직접 시각화와 같은 양적 분석 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서는 하위 마이크로 미터와 하위 밀리 초 spatiotemporal 해상도 개별 뉴런의 전기 활동을 모니터링하기위한 전압에 민감한 염료 기록 방법을 설명합니다. 가까운 최적의 파장 (신호 크기에 관한)에 레이저 여기가 ~ 50 이전 방법여의 비율에 의해 녹음의 감도를 향상되었습니다. 현재 감도는 수석, axons, 축삭의 민간인 피해와 축삭 터미널뿐만 아니라 개인 수지상의 쪽 등의 개인 뉴런의 모든 부분?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리의 공동 친절 염료를 제공하기 위해이 기술의 초기 개발에뿐만 아니라 레슬리 M. 로우에 참가 Knut Holthoff, 아서 Konnerth와 마르코 Canepari에 감사하고 있습니다. NSF 부여 IOS-0817969, NIH 보조금 NS068407와 M136043 의해 예일 대학에서 신경 과학을위한 Kavli 연구소에 의해 지원.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
