Voltage-sensitive Dye Aufnahme von Axonen, Dendriten und dendritischen Spines einzelner Neuronen in Hirnschnitten
Summary
Ein bildgebendes Verfahren zur Überwachung des Membranpotentials Änderungen mit sub-Mikrometer-räumlichen und Sub-Millisekunden zeitlicher Auflösung beschrieben. Die Technik, auf Laseranregung von Spannungs-sensitiven Farbstoffen, ermöglicht Messungen von Signalen in Axonen und Axon Kollateralen, Terminal dendritische Äste, und einzelne dendritischen Dornen.
Abstract
Das Verständnis der biophysikalischen Eigenschaften und funktionelle Organisation der einzelnen Neuronen und wie sie Informationen verarbeiten ist von grundlegender Bedeutung für das Verständnis, wie das Gehirn funktioniert. Die primäre Funktion einer beliebigen Nervenzelle ist, um elektrische Signale, in der Regel von verschiedenen Quellen verarbeiten. Elektrische Eigenschaften neuronaler Prozesse sind außerordentlich komplex, dynamisch und in der allgemeinen Fall unmöglich, in Abwesenheit von detaillierte Messungen vorauszusagen. Um eine solche Messung würde man erhalten, idealerweise gerne in der Lage zu überwachen, an mehreren Standorten, unterschwelligen Ereignisse, wie sie von den Websites der Herkunft auf die neuronale Prozesse und summieren an bestimmten Orten zu Aktionspotential Einleitung beeinflussen reisen. Dieses Ziel wurde in keiner Neuronen aufgrund technischer Einschränkungen von Messungen, die Elektroden beschäftigen erreicht worden. Um diesen Nachteil zu überwinden, ist es höchst wünschenswert, um den Patch-Elektrode Ansatz mit bildgebenden Verfahren, die umfangreiche parallel recordin ermöglichen ergänzengs von allen Teilen eines Neurons. Hier beschreiben wir eine solche Technik – optische Aufzeichnung des Membranpotentials Transienten mit organischen spannungsabhängigen Farbstoffen (V m-imaging) – gekennzeichnet durch Sub-Millisekunden-und Sub-Mikrometer-Auflösung. Unsere Methode basiert auf bahnbrechenden Arbeiten zur Spannungs-sensitive molekulare Sonden 2 basiert. Viele Aspekte der anfänglichen Technologie wurden kontinuierlich über mehrere Jahrzehnte 3, 5, 11 verbessert. Zusätzlich früheren Arbeiten zwei wesentliche Merkmale von V m-imaging dokumentiert. Erstens sind Fluoreszenzsignale linear proportional zu Membranpotentials über den gesamten physiologischen Bereich (-100 mV bis +100 mV, 10, 14, 16). Zweitens, Be-Neuronen mit der Spannung-empfindlichen Farbstoff welche hier (JPW 3028) nicht nachweisbare pharmakologische Wirkungen. Die aufgezeichneten Verbreiterung der Spitze während der Farbstoff Laden ist vollständig reversibel 4, 7. Zusätzlich zeigt experimentelle Hinweise, dass es möglich ist, zu erhalteneine beträchtliche Anzahl (bis zu hundert) von Aufnahmen vor nachweisbare phototoxische Effekte 4, 6, 12, 13. Derzeit nutzen wir die hervorragende Helligkeit und Stabilität einer Laserlichtquelle bei nahezu optimale Wellenlänge, um die Empfindlichkeit des V m-Bildgebungstechnik zu maximieren. Die aktuelle Sensitivität ermöglicht mehreren Standorten optische Aufnahmen von V m Transienten aus allen Teilen eines Neurons, einschließlich Axonen und Axon Sicherheiten, Terminal dendritischen Zweigen, und einzelne dendritische Dornen. Die erfassten Informationen zu Signals Wechselwirkungen kann quantitativ als auch direkt visualisiert in Form eines Films analysiert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieser Artikel beschreibt ein Spannungs-empfindlichen Farbstoff-Aufnahme Verfahren zur Überwachung der elektrischen Aktivität einzelner Neuronen mit sub-Mikrometer-und Sub-Millisekunden-raumzeitliche Auflösung. Laseranregung bei nahezu optimale Wellenlänge (bezüglich Signalgröße) verbessert die Empfindlichkeit der Aufnahme um einen Faktor von ~ 50 gegenüber früheren Ansätzen. Die aktuelle Empfindlichkeit ermöglicht die Überwachung elektrischer Signale aus allen Teilen der einzelnen Neuronen, einschließlich …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar, dass unsere Mitarbeiter Knut Holthoff, Arthur Konnerth und Marco Canepari, die in der Anfangsphase der Entwicklung dieser Technik sowie Leslie M. Loew für die freundliche Bereitstellung Farbstoffe teilgenommen. Unterstützt durch NSF IOS-0817969, NIH Zuschüsse NS068407 und M136043 und Kavli Institute for Neuroscience an der Yale University.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
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