Tensão sensível Gravação Dye de axônios, dendritos e espinhas dendríticas de neurônios individuais em fatias de cérebro
Summary
Uma técnica de imagem para monitoramento de mudanças potenciais de membrana com sub-micrômetro espacial e sub-milissegundo resolução temporal é descrito. A técnica, com base na excitação do laser de corantes sensíveis à voltagem, permite a medição de sinais em axónios e colaterais, ramos terminais axonais e dendríticas individuais espinhas dendriticas.
Abstract
Compreender as propriedades biofísicas e organização funcional dos neurônios e como eles processam a informação é fundamental para a compreensão de como o cérebro funciona. A função primária de uma célula nervosa é processar sinais eléctricos, normalmente a partir de fontes múltiplas. Propriedades eléctricas de processos neuronais são extraordinariamente complexo, dinâmico, e, no caso geral, impossível de prever na ausência de medidas pormenorizadas. Para obter tal medida um seria, idealmente, gostaria de ser capaz de monitorar, em vários sites, eventos subliminares que viajam a partir de sites de origem em processos neuronais e somam em locais específicos para a iniciação do potencial de ação. Este objectivo não foi alcançado em qualquer neurónio devido a limitações técnicas que empregam medições eléctrodos. Para ultrapassar este inconveniente, é altamente desejável para complementar a abordagem de patch-eléctrodo com técnicas de imagiologia que permitem recordin paralela extensogs de todas as partes de um neurônio. Aqui, descrevemos uma técnica como essa – de gravação óptica de transientes de potencial de membrana com orgânicas sensíveis à tensão corantes (V m-imaging) – caracterizada por sub-milissegundo e sub-micrômetro de resolução. Nosso método é baseado no trabalho pioneiro sobre a tensão-sensíveis sondas moleculares 2. Muitos aspectos da tecnologia inicial têm sido continuamente melhorado ao longo de várias décadas 3, 5, 11. Além disso, trabalhos anteriores documentados duas características essenciais do V m-imaging. Em primeiro lugar, os sinais de fluorescência são linearmente proporcional ao potencial de membrana ao longo de toda a gama fisiológica (-100 mV a +100 mV, 10, 14, 16). Em segundo lugar, os neurónios de carga com o corante sensível a tensão usada aqui (JPW 3028) não possui efeitos farmacológicos detectáveis. O alargamento do pico registado durante o carregamento do corante é completamente reversível 4, 7. Adicionalmente, a evidência experimental mostra que é possível obterum número significativo (até centenas) de gravações antes de quaisquer efeitos detectáveis fototóxicas 4, 6, 12, 13. No presente, aproveitar o brilho excelente e estabilidade de uma fonte de luz laser em comprimentos de onda próximo do óptimo para maximizar a sensibilidade da técnica V m-imaging. A sensibilidade atual permite gravações local várias ópticas de transientes V m de todas as partes de um neurônio, incluindo axônios e colaterais dos axônios, ramos dendríticas terminais, e as espinhas dendríticas individuais. A informação adquirida sobre as interacções de sinal pode ser analisado quantitativamente, bem como directamente visualizados sob a forma de um filme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve uma tensão sensível ao método de gravação de corante para monitorar a atividade elétrica dos neurônios individuais com submicrométrica e sub-milissegundo resolução espaço-temporal. A excitação por laser no comprimento de onda próximo do ideal (em termos de dimensão do sinal) melhorou a sensibilidade da gravação por um fator de ~ 50 sobre as abordagens anteriores. A sensibilidade de corrente permite a monitorização de sinais eléctricos a partir de todas as partes de neurónios ind…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos aos nossos colaboradores Knut Holthoff, Arthur Konnerth e Marco Canepari que participou do desenvolvimento inicial da técnica, bem como a Leslie M. Loew por gentilmente fornecer corantes. Apoiada pela NSF concessão IOS-0817969, NIH NS068407 e M136043 e por Kavli Instituto de Neurociência da Universidade de Yale.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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