Enregistrement colorant sensible à la tension d'axones, des dendrites et des épines dendritiques des neurones individuels dans des tranches de cerveau
Summary
Une technique d'imagerie pour le suivi de l'évolution du potentiel de membrane avec une résolution spatiale sous-micrométrique et sub-milliseconde temporelle est décrit. La technique, basée sur une excitation laser de la tension de colorants sensibles, permet de mesurer des signaux dans les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques et terminaux individuels épines dendritiques.
Abstract
Comprendre les propriétés biophysiques et l'organisation fonctionnelle des neurones individuels et la façon dont ils traitent l'information est fondamentale pour comprendre comment fonctionne le cerveau. La fonction principale de toute cellule nerveuse est de traiter des signaux électriques, le plus souvent à partir de sources multiples. Propriétés électriques des processus neuronaux sont extraordinairement complexe, dynamique, et, dans le cas général, impossible de prévoir en l'absence de mesures détaillées. Pour obtenir une telle mesure il faudrait, idéalement, aiment être en mesure de suivre, sur plusieurs sites, événements infraliminaires comme ils voyagent sur les sites d'origine sur les processus neuronaux et Additionnez à des endroits particuliers pour influencer l'initiation du potentiel d'action. Cet objectif n'a pas été atteint dans n'importe quel neurone raison de limitations techniques de mesures qui emploient des électrodes. Pour pallier cet inconvénient, il est hautement souhaitable de compléter l'approche patch-électrode avec les techniques d'imagerie qui permettent une vaste recordin parallèlegs de toutes les parties d'un neurone. Ici, nous décrivons une telle technique – enregistrement optique des transitoires du potentiel de membrane avec organiques sensibles à la tension colorants (V m-imagerie) – caractérisées par des sous-milliseconde et sub-micrométrique résolution. Notre méthode est basée sur un travail de pionnier sur les sensibles à la tension des sondes moléculaires 2. De nombreux aspects de la technologie initiale ont été continuellement améliorée au cours de plusieurs décennies 3, 5, 11. En outre, les travaux antérieurs documentés deux caractéristiques essentielles de V m-imagerie. D'une part, des signaux de fluorescence sont linéairement proportionnelle au potentiel de membrane sur toute la plage physiologique (-100 mV à +100 mV; 10, 14, 16). D'autre part, les neurones de chargement du colorant sensible à la tension utilisée ici (JPW 3028) n'a pas détectables effets pharmacologiques. L'élargissement du pic enregistré lors du chargement de teinture est complètement réversible 4, 7. En outre, les preuves expérimentales montrent qu'il est possible d'obtenir desun nombre important (jusqu'à plusieurs centaines) d'enregistrements avant les effets phototoxiques détectables 4, 6, 12, 13. À l'heure actuelle, nous profitons de la luminosité et la stabilité d'une source de lumière laser à longueur d'onde quasi-optimale pour maximiser la sensibilité du V m-technique d'imagerie. La sensibilité actuelle permet des enregistrements multi-sites optique de m Transitoires V de toutes les parties d'un neurone, y compris les axones et les collatéraux axone, des branches dendritiques de terminaux, et des épines dendritiques individuelles. Les informations acquises sur les interactions de signaux peuvent être analysées quantitativement ainsi que directement visualisée sous la forme d'un film.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article décrit une méthode sensible à la tension colorant d'enregistrement pour surveiller l'activité électrique des neurones individuels avec les sub-micrométrique et sous-milliseconde résolution spatio-temporelle. Excitation laser à longueur d'onde quasi-optimale (en ce qui concerne la taille du signal) a amélioré la sensibilité de l'enregistrement d'un facteur ~ 50 par rapport aux approches précédentes. La sensibilité actuelle permet de surveiller des signaux électriques de tout…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous sommes reconnaissants à nos collaborateurs Knut Holthoff, Arthur Konnerth et Marco Canepari qui ont participé au développement initial de cette technique ainsi que pour Leslie M. Loew a bien voulu fournir des colorants. Soutenue par des subventions NSF grant IOS-0817969, NIH NS068407 et M136043 et par Kavli Institute for Neuroscience à l'Université Yale.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
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