Spenning-sensitive Dye Opptak fra Axoner, dendritter og dendrittiske spines av enkelte nerveceller i hjernen skiver
Summary
En avbildningsteknikk for monitorering av membranpotensialet forandringer med sub-mikrometer romlig og sub-millisekund tidsoppløsning er beskrevet. Teknikken er basert på laser eksitasjon av spenningssensitive fargestoffer, kan målinger av signaler i axoner og axon collaterals, terminal dendritic grener og individuelle dendritic spines.
Abstract
Forstå biofysiske egenskaper og funksjonelle organisering av single nevroner og hvordan de behandler informasjon er grunnleggende for å forstå hvordan hjernen fungerer. Den primære funksjon av noen nervecelle er å behandle elektriske signaler, vanligvis fra flere kilder. Elektriske egenskaper av neuronal prosesser er usedvanlig kompleks, dynamisk, og, i det generelle tilfelle, er umulig å forutsi i fravær av detaljerte målinger. Å få en slik måling en ville, ideelt sett, liker å være i stand til å overvåke, på flere områder, terskelnivået hendelser som de reiser fra nettstedene til opprinnelsen på neuronal prosesser og summate på spesielle steder å påvirke handlingen potensielle innvielse. Dette målet har ikke blitt oppnådd i noen nevron grunn av tekniske begrensninger av målinger som benytter elektroder. For å overvinne denne ulempen, er det svært ønskelig å utfylle patch-elektroden tilnærming med avbildningsteknikker som tillater omfattende parallell Recordings fra alle deler av et nevron. Her beskriver vi en slik teknikk – optisk innspilling av membran potensielle transienter med organiske spenningssensitive fargestoffer (V m-imaging) – preget av sub-millisekund og sub-mikrometer oppløsning. Vår metode er basert på banebrytende arbeid på spenningssensitive molekylære prober 2. Mange aspekter av den opprinnelige teknologien har blitt kontinuerlig forbedret over flere tiår 3, 5, 11. I tillegg, tidligere arbeidserfaring dokumentert to essensielle egenskapene V m-bildebehandling. Først, fluorescens-signaler er lineært proporsjonal til membranpotensialet over hele fysiologiske området (-100 mV til +100 mV, 10, 14, 16). Det andre, lasting nerveceller med spenning-sensitive fargestoff som brukes her (JPW 3028) ikke har påviselige farmakologiske effekter. Den innspilte utvidelse av piggen under fargestoff lasting er fullstendig reversibel 4, 7. I tillegg viser eksperimentelle bevis for at det er mulig å fremskaffeet betydelig antall (opptil flere hundre) av opptak før påvisbare fototoksiske effekter 4, 6, 12, 13. I dag, tar vi fordel av det utmerkede lysstyrke og stabiliteten av et laser lyskilde på nær optimal bølgelengde for å maksimere følsomheten av V m-avbildningsteknikk. Den nåværende følsomhet tillater flere reiser optiske opptak av V m transienter fra alle deler av et nevron, inkludert axoner og axon collaterals, terminal dendrittiske grener, og individuelle dendrittiske spines. Relevant informasjon om signal interaksjoner kan analyseres kvantitativt samt direkte visualisert i form av en film.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkelen beskriver en spenning-sensitive dye opptak metode for å overvåke elektriske aktiviteten enkelte nerveceller med sub-mikrometer og sub-millisekund Spatiotemporal oppløsning. Laser eksitasjon ved nær-optimal bølgelengde (angående signal størrelse) forbedret følsomhet opptaket med en faktor på ~ 50 over tidligere tilnærminger. Den nåværende følsomhet gjør overvåking elektriske signaler fra alle deler av individuelle nevroner, inkludert dendritter, aksoner, axon collaterals og axon terminaler…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er takknemlige for våre samarbeidspartnere Knut Holthoff, Arthur Konnerth og Marco Canepari som deltok i den første utviklingen av denne teknikken samt Leslie M. Loew for vennlig gi fargestoffer. Støttet av NSF stipend IOS-0817969, NIH tilskudd NS068407 og M136043 og ved Kavli Institute for Neuroscience ved Yale University.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
