Spänningskänsliga Dye Inspelning från axoner, dendriter och Dendritutskotten av enskilda nervceller i hjärnan skivor
Summary
En bildteknik för övervakning av membran eventuella förändringar med sub-mikrometer rumsliga och sub-millisekund temporal upplösning beskrivs. Tekniken, som bygger på laser-excitation av spänningskänsliga färgämnen, tillåter mätningar av signaler i axoner och axon säkerheter, terminala dendritiska grenar, och enskilda Dendritutskotten.
Abstract
Förstå biofysiska egenskaper och funktionella organisation av enskilda neuroner och hur de behandlar information är grundläggande för att förstå hur hjärnan fungerar. Den primära funktionen hos alla nervcell är att bearbeta elektriska signalerna, vanligen från flera källor. Elektriska egenskaper hos neuronala processer är utomordentligt komplexa, dynamiska, och, i det allmänna fallet, omöjligt att förutsäga i frånvaro av detaljerade mätningar. För att få en sådan mätning en skulle helst vilja kunna övervaka, på flera ställen, under tröskelvärdet händelser när de reser från områden av ursprung på neuronala processer och summate på särskilda platser för att påverka aktionspotentialens initiering. Detta mål har inte uppnåtts i någon neuron på grund av tekniska begränsningar hos mätningar som använder elektroder. För att övervinna denna nackdel, är det mycket önskvärt att komplettera patch-elektroden strategi med avbildningstekniker som medger omfattande parallella recordings från alla delar av en neuron. Här beskriver vi en sådan teknik – optisk inspelning av membran potential transienter med organiska spänningskänsliga färgämnen (V m-avbildning) – kännetecknas av sub-millisekund och sub-mikrometer upplösning. Vår metod är baserad på banbrytande arbete på spänningskänsliga molekylära sönder 2. Många aspekter av den inledande tekniken har kontinuerligt förbättrats under flera decennier 3, 5, 11. Dessutom tidigare arbete dokumenterat två väsentliga egenskaper V m-avbildning. Första fluorescenssignaler är linjärt proportionell mot membranpotentialen över hela fysiologiska intervallet (-100 mV till +100 mV, 10, 14, 16). Det andra har lastning nervceller med den spänningskänsliga färgämne används här (JPW 3028) inte detekterbara farmakologiska effekter. Den inspelade breddning av spetsen under färgen belastning är helt reversibel 4, 7. Dessutom visar experimentella bevis att det är möjligt att erhållaett betydande antal (upp till hundratals) av inspelningar innan några påvisbara fototoxiska effekter 4, 6, 12, 13. För närvarande tar vi fördel av den utmärkta ljusstyrka och stabiliteten hos en laserljuskälla vid nära optimala våglängden för att maximera känsligheten hos V m-avbildningsteknik. Den nuvarande känslighet tillåter flera webbplats optiska inspelningar av V m transienter från alla delar av en neuron, inklusive axoner och säkerheter axon, terminal grenar dendritiska och enskilda taggar dendritiska. Den förvärvade informationen om signal interaktioner kan analyseras kvantitativt såväl som direkt visualiseras i form av en film.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den här artikeln beskriver en spänning-känslig metod färg inspelning för övervakning elektriska aktiviteten i enskilda nervceller med sub-mikrometer och sub-millisekund Spatiotemporal upplösning. Laserexcitation vid nära optimala våglängden (beträffande signal storlek) förbättrades känsligheten för inspelning med en faktor på ~ 50 jämfört med tidigare metoder. Den nuvarande känslighet möjliggör övervakning elektriska signaler från alla delar av enskilda nervceller, inklusive dendriter, axoner, axo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma för våra samarbetspartners Knut Holthoff, Arthur Konnerth och Marco Canepari som deltog i den inledande utvecklingen av denna teknik samt Leslie M. Loew för vänligt ge färgämnen. Stöds av NSF bidrag IOS-0817969, NIH bidrag NS068407 och M136043 och Kavli Institute for Neuroscience vid Yale University.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Setup components | |||
| Upright Microscope | Olympus Inc. | BX51WI | With three camera ports |
| Motorized Movable Stage | Siskiyou | MXOPi.2 | |
| Epi-fluorescence Condenser for Olympus BX51 | TILL Photonics | 0000-560-11659 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, LLC | AxioExaminer D1 | With three camera ports |
| Motorized Top Plate | Scientifica Limited | MMBP | |
| Epi-fluorescence Condenser for Zeiss AxioExaminer | TILL Photonics | ||
| Data Acquisition Camera | RedShirtImaging LLC | NeuroCCD-SM | High speed, low read noise |
| CCD for IR-DIC | Dage-MTI | IR-1000 | |
| Spinning-Disc Confocal Scanner | Yokogawa | CSU-10 | |
| High Spatial Resolution CCD on Confocal Scanner | PCO AG | PixelFly | 1392×1024 pixels |
| DPSS CW Laser (532 Nm) | CNI Optoelectronics Tech. Co., Ltd | MLL-III-532 400mW | Excitation light source |
| Multi-Mode Fiber Launcher | Siskiyou | SM-CFT | |
| Light Guide | TILL Photonics | 0000-515-11524 | |
| Shutter | Vincent Associates | LS6 | |
| Vibration Isolation Table | Minus k Technology | MK26 | |
| Specific reagents | |||
| Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) | Life Technologies | D-6923 | Voltage sensitive dye |
| Crym-EGFP Mouse Line | GENSAT (MMRRC) | STOCK Tg(Crym-EGFP)GF82Gsat/Mmcd | Sparsely expressing EGFP in Layer 5 cortical neurons |
References
- Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
- Cohen, L. B., Salzberg, B. M. Optical measurement of membrane potential. Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).
- Cohen, L. B., Canepari, M., Zecevic, D. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study. J. Physiol. 580, 463-484 (2007).
- Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D., Canepari, M., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones. J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).
- Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons. J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).
- Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy. Neuron. 55, 633-647 (2007).
- Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge. Biophysical J. 87, 631-639 (2004).
- Loew, L. M. Design and characterization of electrochromic membrane probes. J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).
- Loew, L., Canepari, M., Zecevic, D. Design and use of organic voltage sensitive dyes. Membrane Potential Imaging in the Nervous System. , (2010).
- Palmer, L. M., Stuart, G. J. Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons. J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).
- Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study. J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).
- Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential. J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).
- Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings. J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).
- Wu, J. -. Y., Cohen, L. B., Mason, W. T. Fast multisite optical measurement of membrane potential. A practical guide to technology for quantitative real-time analysis. , 389-404 (1993).
- Yuste, R. . Dendritic Spines. , (2010).
