تقييم وظائف الميتوكوندريا وبقاء الخلية في خلايا الكلى البروتين Overexpressing نظائر الانزيمات C كيناز
Summary
ويرد وصف آثار تفعيل نظائر الانزيمات بروتين كيناز (بي كي سي) C على وظائف الميتوكوندريا المرتبطة التنفس والفسفرة المؤكسدة وعلى بقاء الخلية. النهج يتكيف تقنية الغدانية إلى overexpress انتقائي نظائر الانزيمات PKC في الثقافة الخلية الأولية ومجموعة متنوعة من فحوصات لتحديد وظائف الميتوكوندريا والطاقة حالة من الخلية.
Abstract
ويشارك البروتين كيناز C (بي كي سي) عائلة من نظائر الانزيمات في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. البيانات المتوفرة لدينا تثبت أن الأخيرة PKC ينظم وظيفة الميتوكوندريا الخلوية وحالة الطاقة. تقارير عديدة أثبتت أن تفعيل ε-PKC PKC واحد ويحسن وظيفة الميتوكوندريا في القلب الإقفاري ويتوسط كارديوبروتيكتيون. في المقابل، أظهرت لنا أن تشارك PKC-α وPKC ε في nephrotoxicant التي يسببها ضعف الميتوكوندريا وموت الخلايا في خلايا الكلى. ولذلك، كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج في المختبر من خلايا الكلى الحفاظ على الوظائف في الميتوكوندريا بالموقع نظائر الانزيمات التي يمكن تفعيلها بشكل انتقائي أو PKC تحول دون لتحديد دورها في تنظيم الفسفرة المؤكسدة وبقاء الخلية. تم زراعة الخلايا الأولية الثقافات الكلوي أنبوبي القريبة (RPTC) في ظروف أفضل مما أسفر عن التنفس ونشاط الميتوكوندريا ميتوchondrial الانزيمات مماثلة لتلك التي في RPTC في الجسم الحي. لأن التقنيات التقليدية ترنسفكأيشن (Lipofectamine، الصعق الكهربائي) غير فعالة في الثقافات الأولية ولها آثار ضارة على وظيفة الميتوكوندريا، تم تسليم PKC-ε cDNAs متحولة إلى RPTC من خلال ناقلات الغدانية. هذا النهج القائم على النتائج في ترنسفكأيشن أكثر من 90٪ RPTC مثقف.
هنا، نقدم طرق لتقييم دور PKC-ε في: 1. تنظيم التشكل الميتوكوندريا وظائف المرتبطة توليف ATP، و 2. بقاء RPTC في الثقافة الأولية. يتم تنشيط PKC-ε بواسطة overexpressing النشط جوهري PKC-ε متحولة. هو تحول دون PKC-ε بواسطة overexpressing متحولة غير نشط من PKC-ε. ويتم تقييم وظيفة الميتوكوندريا عن طريق فحص التنفس، سلامة السلسلة التنفسية، وأنشطة الجهاز التنفسي والمجمعات F 0 F 1-أتباز، ATP معدل الإنتاج، والمحتوى ATP. التنفس هوssessed في ديجيتونين-permeabilized RPTC كدولة 3 (التنفس القصوى في وجود ركائز الزائدة وADP) وفكت التنفس. يتم تقييم سلامة السلسلة التنفسية عن طريق قياس أنشطة جميع مجمعات أربعة من السلسلة التنفسية في الميتوكوندريا المعزولة. يتم تقييم قدرة الفسفرة المؤكسدة عن طريق قياس القدرة غشاء الميتوكوندريا، ATP معدل الإنتاج، ونشاط F 0 F 1-أتباز. ويتم تقييم الحالة من الطاقة RPTC من خلال تحديد المحتوى ATP داخل الخلايا. وتصور مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا الحية باستخدام الأحمر MitoTracker 580، صبغة الفلورسنت التي تتراكم على وجه التحديد في الميتوكوندريا، وmonolayers حية يتم فحصها تحت المجهر الفلورسنت. ويتم تقييم جدوى استخدام RPTC annexin V / propidium تلطيخ يوديد تليها التدفق الخلوي لتحديد الخلايا وورام.
تسمح هذه الطرق لتفعيل انتقائي / تثبيط نظائر الانزيمات PKC الفرديةلتقييم دورها في الوظائف الخلوية في مجموعة متنوعة من الظروف الفسيولوجية والمرضية التي يمكن أن تكون مستنسخة في في المختبر.
Protocol
Representative Results
Discussion
النهج المقدمة هنا يسمح للoverexpression من نظائر الانزيمات الفردية PKC في الثقافة الأساسية للخلايا الكلى أنبوبي القريبة. هناك العديد من نقاط القوة لهذا النهج: 1. لأنها تتيح للتحقيق في الآليات التنظيمية في عدد السكان متجانسة من الخلايا (خلايا الكلى الأنبوبي الداني) التي هي ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة، والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى، 2R01DK59558 (لGN). قدم معهد بحوث UAMS بالحركة بدعم من المعاهد الوطنية للصحة المركز الوطني للبحوث منحة UL1 الموارد RR029884 التمويل الجزئي لقياس التدفق الخلوي في كور UAMS. نشكر الدكتور Peipei بينغ (جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، لوس أنجلوس، CA) لتوفير قسامة من اتش يحمل الترميز [كدنا] متحولة السلبية (غير نشط) المهيمن PKC-ε، والدكتور ألين Samarel (جامعة لويولا الطبي؛ مايوود، IL) لتوفير قسامة من ناقلات الغدانية ترميز متحولة بالموقع جوهري من PKC-ε. كما نشكر الدكاترة. بيتر باركر وسودن بيتر (إمبريال كوليدج لندن، لندن، المملكة المتحدة) لتوفير الترميز [كدنا] نشطة جوهري PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
