Beoordeling van Mitochondriale functies en levensvatbaarheid van de cellen in de nier overexpressie Proteïne kinase C-isozymen
Summary
De effecten van activering van eiwit kinase C (PKC) isozymen op mitochondriële functies geassocieerd met ademhaling en oxidatieve fosforylering en cellevensvatbaarheid beschreven. De aanpak past adenovirale techniek om selectief PKC overexpressie isozymen in primaire celkweek en verschillende assays voor mitochondriële functies en energie status van de cel te bepalen.
Abstract
Het eiwit kinase C (PKC) familie van isoenzymen betrokken bij talrijke fysiologische en pathologische processen. Onze recente gegevens tonen aan dat PKC de mitochondriale functie en cellulaire energie status regelt. Talrijke rapporten aangetoond dat de activatie van PKC-a en PKC-ε mitochondriale functie in het ischemische hart en bemiddelt cardioprotectie verbetert. Daarentegen hebben we aangetoond dat PKC-α en PKC-ε zijn betrokken bij nephrotoxicant geïnduceerde mitochondriale dysfunctie en celdood in niercellen. Daarom is het doel van deze studie was een in vitro model van niercellen handhaven actief mitochondriële functies waarin PKC-isozymen kunnen selectief worden geactiveerd of geremd functioneel kunnen de regulatie van oxidatieve fosforylering en celoverleving ontwikkelen. Primaire kweken van renale proximale tubulaire cellen (RPTC) werden gekweekt in omstandigheden die leiden tot verbeterde mitochondriale respiratie en activiteit van mitochondrial enzymen vergelijkbaar met die in RPTC in vivo. Omdat traditionele transfectietechnieken (Lipofectamine, elektroporatie) zijn inefficiënt in primaire culturen en negatieve effecten hebben op de mitochondriale functie, werden PKC-ε mutant cDNA's geleverd aan RPTC door adenovirale vectoren. Deze aanpak resulteert in een transfectie van meer dan 90% gekweekte RPTC.
Hier geven we methodes om de rol van PKC-ε in: 1. regulering van mitochondriale morfologie en de functies van ATP-synthese, en 2. overleving van RPTC in primaire cultuur. PKC-ε wordt geactiveerd door overexpressie de constitutief actieve mutant PKC-ε. PKC-ε wordt geremd door overexpressie de inactieve mutant van PKC-ε. Mitochondriale functie wordt beoordeeld door onderzoeken ademhaling, integriteit van de ademhalingsketen, activiteiten van respiratoire complexen en F 0 F 1-ATPase, productiesnelheid ATP en ATP content. Ademhaling is eenssessed in digitonine-permeabel RPTC als state 3 (maximum ademhaling in de aanwezigheid van overmaat substraten en ADP) en ongekoppelde ademhaling. Integriteit van de ademhalingsketen wordt bepaald door het meten activiteiten van alle vier complexen van de ademhalingsketen in geïsoleerde mitochondria. Capaciteit van oxidatieve fosforylering wordt beoordeeld door de mitochondriale membraanpotentiaal, ATP productiesnelheid, en de activiteit van F 0 F 1-ATPase. Energiestatus van RPTC wordt beoordeeld door de intracellulaire ATP-gehalte. Mitochondriale morfologie in levende cellen gevisualiseerd met behulp MitoTracker Red 580, een fluorescerende kleurstof die specifiek accumuleert in mitochondria en levende monolagen worden onderzocht onder een fluorescentiemicroscoop. RPTC levensvatbaarheid wordt beoordeeld op basis annexine V / propidium iodide kleuring gevolgd door flowcytometrie met apoptose en oncosis bepalen.
Deze methoden maken een selectieve activering / inhibitie van afzonderlijke PKC-isozymenhun rol beoordelen cellulaire functies in verschillende fysiologische en pathologische aandoeningen die kunnen worden gereproduceerd in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde benadering maakt overexpressie van individuele isozymen van PKC in de primaire kweek van renale proximale tubulaire cellen. Er zijn verschillende sterke punten van deze aanpak: 1. Het maakt voor het onderzoeken regulerende mechanismen in een homogene celpopulatie (renale proximale tubulaire cellen) die het primaire doel voor verschillende insults (ischemie, hypoxia, oxidatieve stress), drugs en nephrotoxicants in de nier. 2. Mitochondriële functies in deze in vitro model van RPTC gekweek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health, Nationaal Instituut voor Diabetes en Maag-, Darm-en nierziekten, 2R01DK59558 (aan GN). UAMS Translationeel Onderzoek Instituut ondersteund door de National Institutes of Health National Center for Research Resources subsidie UL1 RR029884 voorzien gedeeltelijke financiering voor flowcytometrie Core bij UAMS. Wij danken Dr Peipei Ping (Universiteit van Californië in Los Angeles, Los Angeles, CA) voor het verstrekken van een hoeveelheid van adenovirus dat cDNA draagt het coderen van de dominante negatieve (niet actief) mutant van PKC-ε en Dr Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) voor het verschaffen van een hoeveelheid van adenovirale vector coderende de constitutief actieve mutant van PKC-ε. We danken ook Drs. Peter Parker en Peter Sugden (Imperial College London, Londen, UK) voor het verstrekken van cDNA dat codeert constitutief actief PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
