La valutazione delle funzioni mitocondriali e la vitalità cellulare in cellule renali proteina chinasi C overexpressing isoenzimi
Summary
Gli effetti di attivazione di proteina chinasi C (PKC) isoenzimi sulle funzioni mitocondriali associate respirazione e fosforilazione ossidativa e sulla vitalità cellulare sono descritti. L'approccio si adatta tecnica adenovirale per sovraesprimere selettivamente isoenzimi PKC in coltura primaria e una varietà di saggi per determinare le funzioni mitocondriali e lo stato energetico della cellula.
Abstract
La proteina chinasi C (PKC) famiglia di isoenzimi è coinvolta in numerosi processi fisiologici e patologici. I nostri dati recenti dimostrano che la PKC regola la funzione mitocondriale e lo stato di energia cellulare. Numerosi rapporti hanno dimostrato che l'attivazione della PKC-a e PKC-ε migliora la funzione mitocondriale nel cuore ischemico e cardioprotettivo media. Al contrario, abbiamo dimostrato che PKC-α e ε-PKC sono coinvolte in nephrotoxicant indotta disfunzione mitocondriale e morte cellulare in cellule renali. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello in vitro di cellule renali mantenere attive le funzioni mitocondriali in cui isoenzimi PKC potrebbe essere selettivamente attivati o inibiti per determinare il loro ruolo nella regolazione della fosforilazione ossidativa e la sopravvivenza cellulare. Colture primarie di cellule renali del tubulo prossimale (RPTC) sono state coltivate in condizioni migliori con conseguente respirazione mitocondriale e l'attività di mitomitocondriale enzimi simili a quelli in RPTC in vivo. Poiché le tecniche di transfezione tradizionali (Lipofectamine, elettroporazione) sono inefficienti in colture primarie e avere effetti negativi sulla funzione mitocondriale, PKC-ε cDNA mutanti sono state consegnate ai RPTC attraverso vettori adenovirali. Questo approccio risulta in trasfezione di oltre il 90% RPTC colta.
Qui, vi presentiamo i metodi per valutare il ruolo della PKC-ε in: 1. regolazione della morfologia mitocondriale e funzioni associate alla sintesi di ATP, e 2. sopravvivenza della RPTC in coltura primaria. PKC-ε viene attivato overesprimono la costitutivamente attivo PKC-ε mutante. PKC-ε è inibita dalla sovraespressione della mutante inattivo di PKC-ε. Funzione mitocondriale viene valutata esaminando la respirazione, l'integrità della catena respiratoria, attività dei complessi respiratori e F 0 F 1-ATPasi, tasso di produzione di ATP, e il contenuto di ATP. La respirazione è unssessed in digitonina permeabilizzate RPTC come stato 3 (respirazione massima in presenza di substrati in eccesso e ADP) e respirazioni disaccoppiati. Integrità della catena respiratoria è valutata misurando attività di tutti e quattro complessi della catena respiratoria nei mitocondri isolati. Capacità di fosforilazione ossidativa viene valutata misurando il potenziale di membrana mitocondriale, tasso di produzione di ATP, e l'attività di F 0 F 1-ATPasi. Stato energetico del RPTC viene valutata determinando il contenuto intracellulare di ATP. Morfologia mitocondriale in cellule vive è visualizzato utilizzando MitoTracker Red 580, un colorante fluorescente che si accumula in particolare nei mitocondri, e monostrati vivi vengono esaminati al microscopio a fluorescenza. Vitalità RPTC è valutato in base annessina V / colorazione ioduro di propidio seguita mediante citometria di flusso per determinare apoptosi e oncosis.
Questi metodi consentono di attivazione selettiva / inibizione della PKC individuale isoenzimiper valutare il loro ruolo in funzioni cellulari in una varietà di condizioni fisiologiche e patologiche che possono essere riprodotti in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'approccio qui presentato consente di sovraespressione di isoenzimi singoli PKC nella coltura primaria di cellule del tubulo prossimale renale. Ci sono diversi punti di forza di questo approccio: 1. Permette di studiare meccanismi di regolazione in una popolazione omogenea di cellule (cellule del tubulo prossimale renale) che sono l'obiettivo primario per insulti vari (ischemia, ipossia, stress ossidativo), farmaci e nephrotoxicants all'interno del rene. 2. Funzioni mitocondriali in questo modello in vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health, Istituto Nazionale del Diabete e Malattie Digestive e Renali, 2R01DK59558 (a GN). MSNA Translational Research Institute sostenuto dal National Institutes of Health Centro Nazionale per la Ricerca Risorse concessione UL1 RR029884 fornito un finanziamento parziale per Core Citometria a Flusso di MSNA. Ringraziamo il Dott. Peipei Ping (Università di California a Los Angeles, Los Angeles, CA) per fornire un 'aliquota di adenovirus portare cDNA codificante il dominante negativo (inattivo) mutante della PKC-ε e il dottor Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) per fornire una aliquota di vettore adenovirale codificante mutante costitutivamente attivo di PKC-ε. Ringraziamo anche Drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, Londra, Regno Unito) per la fornitura di cDNA codificante costitutivamente attivi PKC-ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells. Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).
- Nowak, G., Schnellmann, R. G. L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture. Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).
- Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning. Circ. Res. 84, 587-604 (1999).
- Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. J. Activity of both Raf and Ras is necessary for activation of transcription of the human T cell receptor beta gene by protein kinase C, Ras plays multiple roles. J. Biol. Chem. 268, 17975-17982 (1993).
- Nowak, G., Bakajsova, D., Samarel, A. M. Protein kinase C-ε activation induces mitochondrial dysfunction and fragmentation in renal proximal tubules. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 301, F197-F208 (2011).
- Nowak, G., Clifton, G. L., Godwin, M. L., Bakajsova, D. Activation of ERK1/2 pathway mediates oxidant-induced decreases in mitochondrial function in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, 840-855 (2006).
- Shaik, Z. P., Fifer, E. K., Nowak, G. Akt activation improves oxidative phosphorylation in renal proximal tubular cells following nephrotoxicant injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294, F423-F432 (2008).
- Nowak, G. Protein kinase C-α and ERK1/2 mediate mitochondrial dysfunction, decreases in active Na+ transport, and cisplatin-induced apoptosis in renal cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002).
- Liu, X., Godwin, M. L., Nowak, G. Protein kinase C- a inhibits the repair of oxidative phosphorylation after S-(1,2-dichlorovinyl)-L-cysteine injury in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 287, F64-F73 (2004).
- Nowak, G., Price, P. M., Schnellmann, R. G. Lack of a functional p21WAF1/CIP1 gene accelerates caspase-independent apoptosis induced by cisplatin in renal cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F440-F450 (2003).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Cisplatin-induced renal cell apoptosis: caspase 3-dependent and -independent pathways. J. Pharmacol. Exp. Ther. 302, 8-17 (2002).
