Avaliação de funções mitocondriais e viabilidade celular em células renais Proteína Kinase C superexpressão Isozimas
Summary
Os efeitos da activação da proteína quinase C (PKC) isozimas de funções mitocondriais associadas com a respiração e fosforilação oxidativa e na viabilidade celular são descritos. A abordagem técnica adapta adenoviral para superexpressar selectivamente as isozimas PKC em cultura primária de células e uma variedade de ensaios para determinar as funções mitocondriais e do estado de energia da célula.
Abstract
A proteína quinase C de família (PKC) de isoenzimas está envolvido em vários processos fisiológicos e patológicos. Nossos dados recentes demonstram que PKC regula a função mitocondrial e energético celular. Numerosos relatos demonstraram que a activação de PKC-a e PKC-ε melhora a função mitocondrial do coração isquémica e medeia cardioprotecção. Em contraste, nós demonstramos que a PKC-α e PKC-ε estão envolvidos na nephrotoxicant induzida disfunção mitocondrial e morte celular em células de rim. Portanto, o objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo in vitro de células renais mantendo ativa as funções mitocondriais em que isozimas PKC poderia ser seletivamente ativadas ou inibidas para determinar seu papel na regulação da fosforilação oxidativa e sobrevivência celular. As culturas primárias de células tubulares proximais renais (RPTC) foram cultivadas em condições melhoradas, resultando em respiração mitocondrial e atividade de mitoenzimas mitocondrial semelhantes aos descritos no RPTC in vivo. Porque as técnicas de transfecção tradicionais (Lipofectamine, electroporação) são ineficientes em culturas primárias e têm efeitos adversos sobre a função mitocondrial, PKC-ε cDNAs mutantes foram entregues a RPTC através vectores adenovirais. Esta abordagem resulta em transfecção de mais de 90% RPTC culta.
Aqui, apresentamos métodos para avaliar o papel da PKC-ε em: 1. regulação da morfologia mitocondrial e funções associadas com a síntese de ATP, e 2. sobrevivência de RPTC em cultura primária. PKC-ε é ativado pela superexpressão da constitutivamente ativa PKC-ε mutante. PKC-ε é inibida por superexpressam o mutante inactivo do ε-PKC. A função mitocondrial é avaliada examinando-se a respiração, a integridade da cadeia respiratória, as actividades dos complexos respiratórios e F 0 F 1-ATPase, a taxa de produção de ATP, e teor de ATP. A respiração é umssessed em digitonina-permeabilizadas RPTC como o estado 3 (respiração máxima na presença de substratos em excesso e ADP) e respiração desacoplados. Integridade da cadeia respiratória é avaliada por medição das actividades de todos os quatro complexos da cadeia respiratória nas mitocôndrias isoladas. Capacidade de fosforilação oxidativa é avaliada através da medição do potencial de membrana mitocondrial, a taxa de produção de ATP, e a actividade de F 0 F 1-ATPase. Estado de energia RPTC é avaliada através da determinação do teor de ATP intracelular. Morfologia mitocondrial em células vivas é visualizada utilizando MitoTracker Red 580, um corante fluorescente que se acumula especificamente nas mitocondrias, e monocamadas vivas são examinados sob um microscópio fluorescente. Viabilidade RPTC é avaliada através de anexina V / coloração com iodeto de propídio seguido por citometria de fluxo para determinar a apoptose e oncose.
Estes métodos permitem uma activação selectiva / inibição do indivíduo isozimas PKCpara avaliar o seu papel em funções celulares de uma variedade de condições fisiológicas e patológicas que podem ser reproduzidas em in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
A abordagem aqui apresentada permite a super-expressão de isoenzimas individuais de PKC na cultura primária de células tubulares proximais renais. Há vários pontos fortes da presente abordagem: 1. Ela permite a investigação de mecanismos de regulação de uma população homogénea de células (células tubulares proximais renais) que são o alvo primário para vários insultos (isquemia, hipóxia, estresse oxidativo), drogas e nephrotoxicants dentro do rim. 2. Funções mitocondriais, neste modelo in vitro d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por uma doação do Instituto Nacional de Saúde, Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais, 2R01DK59558 (para GN). UAMS Translational Research Institute financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde Centro Nacional de Pesquisa de Recursos concessão UL1 RR029884 financiou parcialmente Núcleo de Citometria de Fluxo no UAMS. Agradecemos ao Dr. Peipei Ping (Universidade da Califórnia em Los Angeles; Los Angeles, CA) para a prestação de uma alíquota de adenovírus carregando cDNA que codifica o negativo dominante (inativo) mutante da PKC-ε e Allen Dr. Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) para proporcionar uma fracção de vector adenoviral que codifica o mutante constitutivamente activo da PKC-ε. Agradecemos também os drs. Peter Parker e Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) para a prestação de codificação de cDNA constitutivamente ativos PKC ε.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Laminar flow hood | Thermo Electron Corporation | FORMA 1104 |
| 2 ml and 15 ml Dounce tissue grinder | WHEATON | 989-24607, 357544 |
| 85 and 235 micron nylon mesh | Small Parts | CMN – 0085 – 10YD CMN – 0250 – 10YD |
| 50 ml sterile centrifuge tube | BIOLOGIX | BCT-P 50BS |
| 1.5 ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 |
| 35 x 10 mm sterile culture dishes | Corning | 430165 |
| Jouan Centrifuge | Jouan | Jouan CR3 11175704 Rotors: Jouan T40 |
| Adjustable micro-centrifuge | SIGMA | Model 1 – 15 |
| Biological Oxygen Monitor | YSI Incorporated | YSI Model 5300A |
| Single Chamber Micro Oxygen System | YSI Incorporated | 5356S |
| Oxygen Probe | YSI Incorporated | 5331A |
| Circulating Bath | YSI Incorporated | 5310 |
| KCl and Standard Membrane Kit | YSI Incorporated | 5775 |
| Magnetic Stirrer | YSI Incorporated | 5222 |
| Flatbed Recorder | Kipp & Zonen | BD 11E |
| 48-well and 96-well transparent plates | Costar | 3548, 3679 |
| Thermomixer R | Eppendorf | 5355 21919 |
| Orbital shaker MAXQ 2000 | Thermo Scientific | SHKA 2000 |
| Spectra FLUOR Plus (absorbance/fluorescence/luminescence reader) | Tecan | F129005 |
| Water-Jacketed US Autoflow Automatic CO2 Incubator | NUAIRE | NU 4850 |
| 12×75 mm polystyrene culture test tubes for flow cytometry | Fisher Brand | 14-961-20 |
| Axioskop Water immersion objective 63x / 0,90W |
Carl Zeiss | 114846 ACHROPLAN 44 00 67 |
| DMEM / F12 | Cellgro | 99 – 830 – PB |
| DMEM / F12 Ham | Sigma | D 2906 – 1L |
| Deferoxamine Mesylate | Hospira | D110 |
| Collagenase Type I | Worthington | 4196 |
| Trypsin inhibitor | Sigma | T 6522 – 500mg |
| 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) | Invitrogen | T3168 |
| Mitotracker Red | Invitrogen | M22425 |
| ATP Bioluminescence Assay Kit HS II | Roche | 11 699 709 001 |
| Annexin V – FITC solution | BioVision | 1001 – 200 |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur |
References
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