Overvågning plasmidreplikation Live pattedvrceller over flere generationer ved fluorescensmikroskopi
Summary
En fremgangsmåde til at observere de individuelle DNA-molekyler i levende celler er beskrevet. Teknikken er baseret på binding af en fluorescens-mærket lac repressorproteinet til bindingssteder splejset ind DNA'et af interesse. Denne fremgangsmåde kan tilpasses til at følge mange rekombinante DNA'er i levende celler over tid.
Abstract
Få naturligt forekommende plasmider opretholdes i pattedyrceller. Blandt disse er genomer af gamma-herpesvira, herunder Epstein-Barr virus (EBV) og Kaposi sarkom-associeret herpesvirus (KSHV), hvilket forårsager adskillige humane maligniteter 1-3. Disse to genomer replikeres på en godkendt måde, hver med et enkelt viralt protein og cellulære replikationsmaskineri, og overføres til datterceller ved celledeling trods deres mangler traditionelle centromerer 4-8.
Meget arbejde er blevet udført for at karakterisere replikationer af disse plasmid genomer under anvendelse af fremgangsmåder, såsom Southern blotting og fluorescens in situ hybridisering (FISH). Disse metoder er begrænset, selv om. Kvantitativ PCR og Southern blot giver oplysninger om det gennemsnitlige antal plasmider per celle i en population af celler. FISH er en enkelt-celle-assay, som viser både den gennemsnitlige antal og fordelingen af plasmid s per celle i populationen af celler, men er statisk, således at ingen oplysninger om forælder eller afkommet af den undersøgte celle.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til visualisering af plasmider i levende celler. Denne metode er baseret på binding af en fluorescens-mærket lactose repressorprotein til flere steder i plasmidet af interesse 9. DNA'et af interesse er manipuleret til at indeholde cirka 250 tandemgentagelser af lactosen operatøren (lacO) sekvens. Laco er specifikt bundet af lactose repressorproteinet (LacI), der kan fusioneres til et fluorescerende protein. Fusionsproteinet kan enten udtrykkes fra det konstruerede plasmid eller indført i en retroviral vektor. På denne måde er DNA-molekylerne fluorescens-mærket, og derfor bliver synlige via fluorescensmikroskopi. Fusionsproteinet er blokeret fra at binde plasmid-DNA'et ved dyrkning af celler i nærvær af IPTG til plasmiderne er klar til visning.
NDHOLDET "> dette system kan plasmiderne, der skal overvåges i levende celler gennem flere generationer, afslører egenskaber af deres syntese og partitionering til datterceller. Ideal celler er adhærerende, let transfekteres, og har store kerner. Denne teknik er blevet anvendt til at bestemme, at 84% af EBV-afledte plasmider syntetiseres hver generation og 88% af det nyligt syntetiserede plasmider partition trofast til datterceller i HeLa-celler. Par af disse EBV-plasmider blev set at være bundet til eller associeret med søsterkromatider efter deres syntese i S- fase, indtil de blev set at separere som søsterkromatider adskilt i Anaphase 10. Fremgangsmåden anvendes for tiden til at studere replikationen af KSHV genomer i HeLa-celler og SLK celler. HeLa-celler er immortaliserede humane epitelceller, og SLK celler immortaliseret human endothelial celler. Selvom SLK celler oprindeligt blev afledt fra en KSHV læsion, hverken HeLa eller SLK cellelinie naturligt HarbÖrs KSHV genomer 11. Ud over at studere viral replikation, kan denne visualisering teknik anvendes til at undersøge virkningerne af tilsætningen, fjernelse eller mutation af forskellige DNA-sekvenselementer til syntese, lokalisering og opdeling af andre rekombinante plasmid-DNA'er.Protocol
Representative Results
Discussion
Den her beskrevne metode kan anvendes til at følge plasmider i levende pattedyrceller over tid spænder over flere generationer. Ved at begrænse eksponering for excitationslys, har vi brugt disse teknikker til at følge celler fra nyligt delte par gennem kolonier af 16-32 celler, der repræsenterer mindst 72 timer og 3 celledelinger. Disse eksperimenter giver oplysninger, der ikke kan fås fra statiske assays, såsom kvantitativ PCR, Southern blotting, og FISH.
Det er vigtigt at screene kl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af tilskud fra NIH og ACS, herunder T32CA009135, CA133027, CA070723 og CA022443. Bill Sugden er en American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
