Surveillance de la réplication plasmidique dans les cellules de mammifères en direct sur plusieurs générations par microscopie à fluorescence
Summary
Procédé d'observation des molécules d'ADN dans des cellules vivantes individuelles est décrit. La technique est basée sur la liaison d'une protéine répresseur lac marqué par fluorescence à des sites de liaison d'ingénierie dans l'ADN d'intérêt. Ce procédé peut être adapté pour suivre plusieurs ADNs recombinants dans des cellules vivantes dans le temps.
Abstract
Peu de plasmides d'origine naturelle sont maintenus dans des cellules de mammifères. Parmi ceux-ci sont des génomes des herpèsvirus gamma, y compris les virus Epstein-Barr (EBV) et sarcome de Kaposi associé au virus de l'herpès (KSHV), qui provoquent de multiples tumeurs malignes humaines 1-3. Ces deux génomes sont répliquées de manière licence, chacun utilisant une seule protéine virale et de la machinerie de réplication cellulaire, et sont transmis aux cellules filles lors de la division cellulaire en dépit de leurs centromères traditionnels manquent 4-8.
Beaucoup de travail a été fait pour caractériser les répliques de ces génomes plasmidiques en utilisant des méthodes telles que transfert de Southern et hybridation fluorescente in situ (FISH). Ces méthodes sont limitées, cependant. PCR quantitative et transferts de Southern fournir des informations sur le nombre moyen de plasmides par cellule dans une population de cellules. FISH est un test unicellulaire qui révèle à la fois le nombre et la répartition moyenne de plasmide s par cellule dans la population de cellules, mais est statique, ce qui permet pas d'informations sur la société mère ou la descendance de la cellule examinée.
Ici, nous décrivons une méthode pour visualiser plasmides dans des cellules vivantes. Cette méthode est basée sur la liaison d'une protéine fluorescente marqués répresseur lactose à des sites multiples dans le plasmide d'intérêt 9. L'ADN d'intérêt est conçu pour inclure environ 250 répétitions en tandem de l'opérateur lactose (lacO) séquence. LacO est spécifiquement lié par la protéine répresseur lactose (LACI), qui peut être fusionnée à une protéine fluorescente. La protéine de fusion peut être exprimée à partir du plasmide génétiquement ou introduit par un vecteur rétroviral. De cette façon, les molécules d'ADN sont marqués par fluorescence et deviennent donc visibles par microscopie à fluorescence. La protéine de fusion est bloquée de lier l'ADN plasmidique par culture de cellules en présence d'IPTG jusqu'à ce que les plasmides sont prêtes à être visualisées.
ontenu "> Ce système permet aux plasmides à surveiller dans les cellules vivantes à travers plusieurs générations, révélant les propriétés de leur synthèse et de partitionnement aux cellules filles. Idéal cellules sont adhérentes, facilement transfectées, et ont de gros noyaux. Cette technique a été utilisée pour déterminer que 84% de l'EBV plasmides dérivés sont synthétisés chaque génération et 88% de la partition nouvellement synthétisé plasmides fidèlement aux cellules filles dans des cellules HeLa. Paires de ces plasmides EBV ont été vus pour être attachés ou associés à chromatides sœurs après leur synthèse dans S- phase jusqu'à ce que ils ont été vus pour séparer les chromatides sœurs séparés dans Anaphase 10. La méthode est actuellement utilisée pour étudier la réplication des génomes KSHV dans des cellules HeLa et les cellules SLK. cellules HeLa sont immortalisés cellules épithéliales humaines, et les cellules sont immortalisées SLK endothéliales humaines cellules. Bien que les cellules SLK ont été à l'origine dérivé d'une lésion KSHV, ni la lignée cellulaire HeLa, ni SLK naturellement harbeurs génomes KSHV 11. En plus d'étudier la réplication virale, cette technique de visualisation peut être utilisée pour étudier les effets de l'ajout, la suppression ou la mutation des divers éléments de séquence d'ADN sur la synthèse, la localisation et le partitionnement des autres recombinantes ADN plasmidiques.Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite ici peut être utilisé pour suivre en direct plasmides dans les cellules de mammifères au cours du temps couvrant plusieurs générations. En limitant l'exposition à la lumière d'excitation, nous avons utilisé ces techniques pour suivre les cellules de paires nouvellement divisées par des colonies de cellules 16-32, représentant au moins 72 heures et 3 divisions cellulaires. Ces expériences fournissent des informations qui ne peuvent être obtenues à partir d'essais statiques te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions du NIH et de l'ACS, y compris T32CA009135, CA133027, CA070723, CA022443 et. Le projet de loi Sugden est un professeur American Cancer Society Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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