Monitoraggio replica plasmide in cellule di mammifero in diretta nel corso di generazioni multiple mediante microscopia a fluorescenza
Summary
Un metodo di osservazione singole molecole di DNA in cellule vive è descritto. La tecnica si basa sul legame di una proteina fluorescente etichettato repressore lac di siti di legame ingegnerizzati nel DNA di interesse. Questo metodo può essere adattato per seguire molti DNA ricombinanti in cellule vive nel tempo.
Abstract
Pochi plasmidi presenti naturalmente sono mantenuti in cellule di mammifero. Tra questi sono genomi di gamma-herpesvirus, incluse Epstein-Barr (EBV) e sarcoma di Kaposi associato herpesvirus (KSHV), che causano più malignità umane 1-3. Questi due genomi sono replicati in modo licenza, ciascuno utilizzando una singola proteina virale e macchinari replicazione cellulare, e sono passati alle cellule figlie durante la divisione cellulare, nonostante i loro centromeri privi tradizionali 4-8.
Molto lavoro è stato fatto per caratterizzare le repliche di questi genomi plasmide utilizzando metodi come assorbente meridionale e ibridazione in situ fluorescente (FISH). Questi metodi sono limitati, però. Quantitativa PCR e Southern blot fornire informazioni circa il numero medio di plasmidi per cellula in una popolazione di cellule. FISH è una cella singola saggio che rivela il numero medio e la distribuzione del plasmide s per cella nella popolazione di cellule, ma è statico, permettendo alcuna informazione circa il genitore o progenie della cellula esaminata.
Qui, si descrive un metodo per la visualizzazione plasmidi in cellule vive. Questo metodo è basato sul legame di una proteina fluorescente etichettato lattosio repressore di diversi siti del plasmide di interesse 9. Il DNA di interesse è progettato con circa 250 ripetizioni in tandem dell'operatore lattosio (Laco) sequenza. Laco è specificamente legato dalla proteina repressore lattosio (LacI), che può essere fusa ad una proteina fluorescente. La proteina di fusione può essere espresso dal plasmide ingegnerizzato o introdotto da un vettore retrovirale. In questo modo, le molecole di DNA vengono fluorescently etichettato e quindi diventano visibili tramite microscopia a fluorescenza. La proteina di fusione è bloccato da legare il DNA plasmidico da cellule di coltura in presenza di IPTG finché i plasmidi sono pronti per essere visti.
ONTENUTO "> Questo sistema permette i plasmidi da monitorare in cellule viventi per diverse generazioni, rivelando proprietà dei loro sintesi e partizionamento cellule figlie. ideali sono cellule aderenti, facilmente trasfettate, e hanno grandi nuclei. Questa tecnica è stata utilizzata per determinare che 84% di EBV-derivati plasmidi sono sintetizzati ogni generazione e l'88% della partizione di nuova sintesi plasmidi fedelmente alle cellule figlie in cellule HeLa. Coppie di questi plasmidi EBV sono stati visti da essere legati o associati ai cromatidi fratelli dopo la loro sintesi in S- fase fino a quando non sono stati visti per separare i cromatidi fratelli separati in anafase 10. Il metodo è attualmente utilizzato per studiare la replicazione dei genomi KSHV in cellule HeLa e cellule SLK. cellule HeLa sono immortalati cellule epiteliali umane, e le cellule SLK sono immortalati endoteliali umane cellule. Anche se le cellule SLK sono stati originariamente derivato da una lesione KSHV, né la linea di cellule HeLa, né SLK naturalmente harbors genomi KSHV 11. Oltre a studiare la replicazione virale, questa tecnica di visualizzazione può essere usato per studiare gli effetti l'aggiunta, la rimozione o la mutazione dei vari elementi di sequenza del DNA di sintesi, la localizzazione e il partizionamento di altri DNA plasmidico ricombinante.Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui descritto può essere utilizzato per seguire plasmidi in cellule di mammifero in diretta nel corso del tempo che attraversa più generazioni. Limitando l'esposizione alla luce di eccitazione, abbiamo usato queste tecniche per seguire le cellule da coppie di nuova divisi in colonie di 16-32 cellule, che rappresentino almeno 72 ore e 3 divisioni cellulari. Questi esperimenti forniscono informazioni che non possono essere ottenuti da test statici come la PCR quantitativa, cancellando meridionale, e FISH. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni da parte del NIH e ACS, tra cui T32CA009135, CA133027, CA070723 e CA022443. Bill Sugden è una società americana di Professor Cancer Research.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
- Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas. N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).
- Chang, Y., et al. Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi’s sarcoma. Science. 266, 1865-1869 (1994).
- Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. . Fields Virology 2 volume set. , (2006).
- Adams, A. Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells. J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).
- Humme, S., et al. The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).
- Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. The minimal replicator element of the Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner. J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).
- Yates, J. L., Guan, N. Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells. J. Virol. 65, 483-488 (1991).
- Ye, F. C., et al. Disruption of Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence. J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).
- Robinett, C. C., et al. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).
- Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells. Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).
- Herndier, B. G., et al. Characterization of a human Kaposi’s sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals. Aids. 8, 575-581 (1994).
- Zhou, F. C., et al. Efficient infection by a recombinant Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis. J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).
- Pawley, J. B., Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 59-79 (2006).
- Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C., Pawley, J. B. Image enhancement by deconvolution. Handbook of biological confocal microscopy. , 488-500 (2006).
