Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie
Summary
Verfahren zur Beobachtung der einzelnen DNA-Molekülen in lebende Zellen beschrieben. Die Technik basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Proteins an lac-Repressor-Bindungsstellen in die DNA von Interesse entwickelt basiert. Dieses Verfahren kann gut auf rekombinanten DNAs in lebende Zellen im Laufe der Zeit zu folgen.
Abstract
Einige natürlich vorkommende Plasmide in Säuger-Zellen aufrechterhalten. Unter diesen sind Genomen von Gamma-Herpesviren, einschließlich Epstein-Barr-Virus (EBV) und Kaposi-Sarkom assoziierte Herpes-Virus (KSHV), die mehrere menschlichen Malignitäten 1-3 verursachen. Diese beiden Genomen sind in einem lizenzierten Weise jede Verwendung eines einzigen viralen Proteins und zellulären Replikationsmaschinerie repliziert und an Tochterzellen weitergegeben während der Zellteilung trotz ihrer fehlenden traditionellen Centromeren 4-8.
Viel Arbeit wurde getan, um die Wiederholungen dieser Plasmid Genome Charakterisierung mit Methoden wie Southern-Blot-und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Methoden sind beschränkt, though. Quantitative PCR und Southern-Blots geben Auskunft über die durchschnittliche Anzahl von Plasmiden pro Zelle in einer Population von Zellen. FISH ist ein Single-Zell-Assay, der sowohl die durchschnittliche Anzahl und die Verteilung von Plasmid enthüllt s pro Zelle in der Population von Zellen, jedoch statisch ist, so dass keine Informationen über die Eltern oder Nachkommen des untersuchten Zelle.
Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung von Plasmiden in lebenden Zellen. Dieses Verfahren basiert auf der Bindung eines fluoreszenzmarkierten Lactose Repressorproteins an mehrere Stellen des Plasmids von Interesse 9 basiert. Die DNA von Interesse wird ausgeführt, um etwa 250 Tandemwiederholungen des Lactose-Operator (LacO)-Sequenz umfassen. LacO speziell vom Lactose-Repressor-Protein (LacI), die mit einem fluoreszierenden Protein fusioniert werden kann, gebunden. Das Fusionsprotein kann entweder aus dem konstruierten Plasmids oder eingeführt durch einen retroviralen Vektor exprimiert werden. Auf diese Weise werden die DNA-Moleküle fluoreszierend markierten und damit sichtbar werden über Fluoreszenzmikroskopie. Das Fusionsprotein wird die Bindung der Plasmid-DNA durch Kultivieren von Zellen in der Gegenwart von IPTG blockiert, bis die Plasmide bereit, zu betrachten sind.
nhalt "> Dieses System ermöglicht die Plasmide in lebenden Zellen über mehrere Generationen, offenbart Eigenschaften ihrer Synthese und Partitionierung Tochterzellen überwacht werden. Ideal Zellen haftende, leicht transfiziert und haben große Kerne. Diese Technik wurde verwendet, um festzustellen, dass 84% der EBV-abgeleitete Plasmide jede Generation synthetisiert und 88% des neu synthetisierten Plasmide Partition getreu Tochterzellen in HeLa-Zellen. Paare dieser EBV Plasmide wurden als zu angebunden werden oder damit verbunden Schwesterchromatiden nach ihrer Synthese in der S- Phase bis sie gesehen wurden, wie die Schwesterchromatiden in Anaphase 10 getrennt voneinander zu trennen. Die Methode wird derzeit verwendet, um die Replikation von KSHV Genome in HeLa-Zellen und SLK Zellen zu untersuchen. HeLa-Zellen werden immortalisierten humanen Epithelzellen und SLK Zellen immortalisierten humanen Endothelzellen Zellen. Obwohl SLK Zellen wurden ursprünglich aus einem KSHV Läsion abgeleitet, weder die HeLa noch SLK Zelllinie natürlich harbors KSHV Genome 11. Neben dem Studium Virusreplikation kann diese Visualisierungstechnik verwendet, um die Wirkungen der Zugabe, Entfernen oder Mutation der DNA-Sequenz verschiedenen Elemente auf Synthesegas-, Lokalisierungs-und Partitionierung von anderen rekombinanten Plasmid-DNAs zu untersuchen.Protocol
Representative Results
Discussion
Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um die Plasmide in lebenden Säugetierzellen zeitlich über mehrere Generationen zu folgen. Durch die Begrenzung der Exposition gegenüber Anregungslicht, haben wir diese Techniken verwendet, um Zellen aus neu eingeteilt paarweise durch Kolonien von 16-32 Zellen folgen, die mindestens 72 Stunden und 3 Zellteilungen. Diese Versuche liefern Informationen, die nicht vom statischen Assays wie quantitative PCR, Southern Blotting und FISH erhalten werden kann.
<p clas…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der NIH und ACS, einschließlich T32CA009135, CA133027, CA070723 und CA022443 finanziert. Bill Sugden ist ein American Cancer Society Research Professor.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11965 | |
| OptiMEM | GIBCO | 31985 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30910.03 | |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma | S9137 | |
| Hygromycin | Calbiochem | 400050 | 400 μg/ml for SLK; 300 μg/ml for HeLa |
| Isopropyl-b-D-thiogalactoside (IPTG) | Roche | 10 724 815 001 | Final concentration 200 μg/ml |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| HEPES | GIBCO | 15630 | |
| Glass-bottom dishes | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| CultFoil | Pecon | 000000-1116-08 | |
| Axiovert 200M | Zeiss | ||
| Colibri | Zeiss | 423052-9500-000 | |
| Neutral white LED | Zeiss | 423052-9120-000 | |
| Filter Cube 75 HE | Zeiss | 489075-0000-000 | |
| Plan-Apochromat 63x/1.4 objective | Zeiss | 440762-9904-000 | |
| CascadeII:1024 EMCCD camera | Photometrics | B10C892007 | |
| Tempcontrol mini | Zeiss/Pecon | 000000-1116-070 | |
| Tempcontrol 37-2 digital | Zeiss/Pecon | 000000-1052-320 | |
| CTI Controller 3700 digital | Zeiss/Pecon | 411856-9903 | |
| Objective heater | Zeiss/Pecon | 440760-0000-000 | |
| Stage heating insert P | Zeiss/Pecon | 411861-9901-000 | |
| Stage-top Incubator S | Zeiss/Pecon | 411860-9902-000 | |
| Humidifier System | Zeiss/Pecon | 000000-1116-065 |
References
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