使用时间的推移显微镜可视化缺氧诱导假死<em> C.线虫</em>胚胎
Summary
这里描述的是一个<em在体内</em>技术图像亚细胞结构在动物中使用的气体流通过在纺丝盘共聚焦显微镜连同microincubation室暴露于缺氧。这种方法非常简单，具有足够的灵活性，以适应各种实验参数和模型系统。
Abstract
已caenorhabdits线虫广泛使用在研究的胁迫抗性的成人和胚胎阶段的透明度，以及由遗传突变体和转基因株表达融合蛋白1-4无数的可用性，这是便利的。此外，可以被视为使用荧光标记的记者蛋白的动态过程，如细胞分裂。有丝分裂的研究，可以促进通过使用时间推移实验在各种系统中，包括完整的生物体，因此早期C.线虫的胚胎非常适合这项研究。这里介绍的是一种技术，其中在响应于缺氧（纯度为99.999％的N 2的 <2 ppm O 2） 在体内成像的亚细胞结构应力是可能使用一个简单的气体流通过安装在一个高功率的显微镜。 ，甲microincubation室中使用结合用氮气流过和纺丝盘共聚焦显微镜创建一个受控的环境，在该环境中的动物可以在体内成像。用GFP标记的伽玛微管蛋白和组蛋白的动力学和逮捕的细胞分裂，可监视之前，期间和之后暴露于缺氧的环境。这种技术的高分辨率，详细的视频和图像的细胞结构内暴露于缺氧的胚胎卵裂球的结果。
Protocol
1。样品制备生产或获得适当的转基因C.线虫应变计用转基因的方法，或从秀丽隐杆线虫基因联合中心（CGC），或同事。在这种情况下，我们使用的菌株TH32（ 馅饼1 :: TBG-1 :: GFP饼1 :: GFP :: H2B）5可视化标记细胞分裂染色体和中心体。 生成一个同步的人口使用以下三种方法之一：1）瓦解妊娠成人次氯酸钠溶液，并使用剩余的胚胎，2）种子盘上挑妊娠的成年?…
Representative Results
线虫胚胎暴露于严重缺氧（缺氧）是能够生存下去，逮捕生物过程，包括发展和细胞分裂的7。细胞分裂的缺氧诱导逮捕可以被监测，在亚细胞水平，通过用氮气流过和纺丝盘共聚焦显微镜结合使用microincubation室创建一个受控的环境，在该环境中的动物可以在体内成像（ 图1）。蜂窝结构可以监视在胚胎暴露于各种气体的环境中，在这种情况下，我们用GFP标记的?…
Discussion
缺氧和假死
虽然暴露于严重缺氧可能是致命的一些生物，有些生物能够生存暴露于缺氧。在的情况下的 C 线虫 ，缺氧的生存依赖于发育阶段，对缺氧的反应是一个可逆的假死状态进入观察到的生物过程中，一些被逮捕。细胞分裂，发展，运动，饮食和生殖过程停止，直到的氧气重新引入环境7,9。缺氧暴露的胚胎，细胞周期进程，可逆逮捕相间，下旬前期或…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
从的帕迪拉实验室成员的意见和评论，我们想表达我们的感谢。线虫株在这项工作中所提供的秀丽隐杆线虫的遗传学中心，这是由美国国立卫生研究院国家研究资源中心（NCRR）。我们承认并感谢经度特恩布尔博士激光共聚焦显微镜技术援助。这项工作已经得到了美国国家科学基金会（NSF-IOS，职业）的资助PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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Tags
Time Lapse MicroscopyAnoxia-induced Suspended AnimationC. Elegans EmbryosStress ResistanceGenetic MutantsTransgenic StrainsFusion ProteinsFluorescently Labeled Reporter ProteinsMitosisIn Vivo ImagingSub-cellular StructuresAnoxic StressGas Flow SetupHigh-powered MicroscopeMicroincubation ChamberNitrogen Gas Flow ThroughSpinning Disc Confocal MicroscopeControlled EnvironmentGFP-tagged Gamma TubulinHistoneCell Division ArrestOxygen Deprivation
Cite This Article
Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).