L'uso della microscopia Time lapse di visualizzare anossia indotta Suspended Animation in<em> C. elegans</em> Embrioni
Summary
Qui descritto è un<em> In vivo</em> Tecnica di immagine strutture subcellulari in animali esposti ad anossia utilizzando un flusso di gas attraverso la camera microincubation in congiunzione con un microscopio confocale disco rotante. Questo metodo è semplice e flessibile abbastanza per soddisfare una varietà di parametri sperimentali e sistemi modello.
Abstract
Elegans Caenorhabdits è stato ampiamente utilizzato nello studio della resistenza alle sollecitazioni, che è facilitato dalla trasparenza degli stadi adulti ed embrioni nonché dalla disponibilità di mutanti genetici e ceppi transgenici che esprimono una miriade di proteine di fusione 1-4. Inoltre, i processi dinamici come la divisione cellulare può essere visualizzato utilizzando proteine del reporter fluorescente etichettati. Lo studio della mitosi può essere facilitata attraverso l'utilizzo di time-lapse esperimenti in vari sistemi, compresi gli organismi intatti e di conseguenza l'inizio C. embrione elegans è adatto per questo studio. Presentato qui è una tecnica con la quale immagini in vivo di strutture subcellulari in risposta a anossica (99.999% N 2; <2 ppm O 2) lo stress è possibile con un semplice flusso di gas attraverso la configurazione di un potente microscopio. Una camera microincubation viene utilizzato in combinazione con un flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotanteper creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo. Utilizzando GFP-tubulina gamma etichettato e istoni, la dinamica e arresto della divisione cellulare può essere monitorato prima, durante e dopo l'esposizione ad un ambiente privo di ossigeno. I risultati di questa tecnica sono ad alta risoluzione, video e immagini dettagliate delle strutture cellulari all'interno blastomeri di embrioni esposti a deprivazione di ossigeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Privazione di ossigeno e Suspended Animation
Sebbene l'esposizione alla carenza di ossigeno grave può essere fatale per alcuni organismi, alcuni organismi sono in grado di sopravvivere l'esposizione a anossia. Nel caso di C. elegans, la sopravvivenza di esposizione anossia dipende stadio di sviluppo e la risposta alla anossia è entrata in uno stato di animazione sospesa reversibile in cui sono stati arrestati una serie di processi biologici osservabili. Processi di divisione …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo esprimere il nostro apprezzamento per l'ingresso e commenti dei membri del laboratorio Padilla. Ceppi di nematodi in questo lavoro sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center, che è finanziato dalla National NIH Center for Research (NCRR). Prendiamo atto e ringraziamo il Dott. Lon Turnbull per l'assistenza tecnica con la microscopia confocale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIERA) per PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
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