In Oksijen yetersizliği kaynaklı Asma Animasyon Visualize'a Time Lapse Mikroskopi kullanın<em> C. elegans</em> Embriyolar
Summary
Bir burada tarif edilmekte<em> In vivo</emBir dönen diske konfokal mikroskop ile birlikte microincubation odasından geçen bir gaz akımı kullanılarak anoksi maruz kalan hayvanlarda resim alt hücresel yapılara> tekniktir. Bu yöntem basit ve deneysel parametreleri ve model sistemleri çeşitli uyacak kadar esnek.
Abstract
Caenorhabdits elegans yetişkin ve embriyo aşamalarında şeffaflık yanı sıra füzyon proteinleri 1-4 sayısız ifade genetik mutantlar ve transgenik suşların durumu kolaylaştırılır strese dayanıklılığı çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, hücre bölünmesi gibi dinamik süreçleri floresan etiketli muhabiri proteinleri kullanılarak izlenebilir. Mitoz çalışma dokunulmamış organizmalar dahil olmak üzere çok çeşitli sistemler de hızlandırılmış deneylerinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir ve böylece ilk C. elegans embriyo de bu çalışma için uygundur. Yüksek güçlü bir mikroskop kurulum ile basit bir gaz akışı kullanarak stres mümkündür; Sunan burada anoksik yanıt (<2 ppm O 2% 99.999 N 2) alt hücresel yapıların in vivo görüntüleme hangi bir tekniktir. Bir microincubation odasından geçen azot gazı akışı ve dönen bir disk konfokal mikroskop ile birlikte kullanılırhayvanlarda in vivo yansıması hangi kontrollü bir ortam oluşturmak için. Kullanma GFP etiketli gama tübülin ve histon, dinamikleri ve hücre bölünmesi tutuklama sırasında ve bir oksijen-yoksun ortama maruz kaldıktan sonra, önce izlenebilir. Bu tekniğin sonuçları oksijen yoksunluğu maruz embriyoların blastomer içinde yüksek çözünürlüklü, ayrıntılı video ve hücresel yapıların görüntülerdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oksijen Yoksunluğu ve Asma Animasyon
Ciddi oksijen yoksunluğu maruz bazı organizmalar için ölümcül olabilir rağmen, bazı organizmalar anoksi maruz hayatta edebiliyoruz. C. halinde elegans, anoksi maruziyet sağkalım gelişim safhasına ve anoksi yanıtın bağlıdır girişi gözlemlenebilir biyolojik süreçlerin bir dizi tutuklandı edildiği askıya animasyon bir tersinir durum içine. Oksijen ortamında 7,9 tekrar geri kadar Hücre bölünmesi, gelişm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz giriş ve Padilla Lab üyeleri yorumlarına için takdir ifade etmek istiyorum. Bu çalışmada Nematod suşları Araştırma Kaynakları için NIH Ulusal Merkezi (NCRR) tarafından finanse edilmektedir Caenorhabditis Genetik Merkezi tarafından sağlanmıştır. Biz konfokal mikroskopi ile teknik yardım için Dr Lon Turnbull kabul ve teşekkür ederim. Bu çalışma PAP Ulusal Bilim Vakfı (NSF-IOS, KARİYER) hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis elegans. , 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, P. A., Padilla, . Anoxia. , (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
