समय चूक माइक्रोस्कोपी के प्रयोग में कल्पना अनॉक्सिता प्रेरित निलंबित एनिमेशन<em> सी. एलिगेंस</em> भ्रूण
Summary
यहाँ वर्णित एक<em> Vivo में</emअनॉक्सिता microincubation कक्ष के माध्यम से एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ संयोजन के रूप में गैस के प्रवाह का उपयोग करने के लिए संपर्क में पशुओं में छवि उप सेलुलर संरचनाओं के लिए तकनीक. इस पद्धति का सीधा और काफी लचीला के लिए प्रयोगात्मक मानकों और मॉडल प्रणाली के एक किस्म के अनुरूप है.
Abstract
Caenorhabdits एलिगेंस तनाव प्रतिरोध है, जो वयस्क और भ्रूण चरणों के पारदर्शिता के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आनुवंशिक म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक उपभेदों एक संलयन प्रोटीन 1-4 की असंख्य व्यक्त की उपलब्धता की है के अध्ययन में किया गया है बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है. इसके अलावा, ऐसे कोशिका विभाजन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं fluorescently लेबल संवाददाता प्रोटीन का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है. पिंजरे का बँटवारा की अध्ययन बरकरार जीवों सहित विभिन्न प्रणालियों में समय चूक प्रयोगों के प्रयोग के माध्यम से की जा सकती है, इस प्रकार जल्दी सी. एलिगेंस भ्रूण अच्छी तरह से इस अध्ययन के लिए अनुकूल है. तनाव एक उच्चस्तरीय खुर्दबीन पर स्थापना के माध्यम से संभव है एक सरल गैस प्रवाह का उपयोग कर, यहाँ प्रस्तुत एक तकनीक है जिसके द्वारा anoxic प्रतिक्रिया (<2 पीपीएम 2 हे 99,999% एन 2) में उप सेलुलर संरचनाओं के vivo इमेजिंग में है. Microincubation कक्ष नाइट्रोजन गैस के माध्यम से प्रवाह और एक कताई डिस्क confocal खुर्दबीन के साथ संयोजन के रूप में प्रयोग किया जाता हैएक नियंत्रित वातावरण में जो जानवरों vivo में imaged किया जा सकता है बनाने के लिए. का प्रयोग GFP टैग गामा ट्यूबिलिन और histone, गतिशीलता और कोशिका विभाजन की गिरफ्तारी से पहले नजर रखी जा सकता है के दौरान और एक ऑक्सीजन से वंचित पर्यावरण के लिए जोखिम के बाद. इस तकनीक के परिणाम ऑक्सीजन के अभाव को उजागर भ्रूण की blastomeres भीतर उच्च संकल्प, विस्तृत और वीडियो सेलुलर संरचनाओं के चित्र हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
ऑक्सीजन के अभाव और निलंबित एनिमेशन
हालांकि गंभीर ऑक्सीजन के अभाव में जोखिम कुछ जीवों के लिए घातक हो सकती है, कुछ जीवों अनॉक्सिता के लिए जोखिम को जीवित करने में सक्षम हैं. सी. के मामले में ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इनपुट और Padilla लैब के सदस्यों से टिप्पणी के लिए हमारी प्रशंसा व्यक्त करना चाहते हैं. इस काम में निमेटोड उपभेदों Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र, जो अनुसंधान संसाधन के लिए NIH राष्ट्रीय केंद्र (NCRR) द्वारा वित्त पोषित है द्वारा प्रदान किया गया. हम स्वीकार करते हैं और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ तकनीकी सहायता के लिए डा. Lon Turnbull धन्यवाद. यह काम पीएपी के लिए राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (NSF IOS, कैरियर) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
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